Uno sbozzo al traduttore automatico, ma che ch'azzecca sta roba ?
ah già siamo in OT, magari con calma, ce la spieghi, da un'altra parte però perchè questa la chiudo.
La biochimica clinica 35 (2002) 425-445
Visualizzazione
Phage espone la tecnologia: domande cliniche e le innovazioni recenti
Hassan M. E. Azzazya, |b|,*, W. Edward Highsmith, Jra
ADepartment di patologia, la scuola di University of Maryland di medicina, Baltimore, USA
BDepartment di medico ed indagano tecnologia, la scuola di University of Maryland di medicina, Baltimore, USA
Astragga
La mostra di Phage è una tecnologia di diversità molecolare che permette la presentazione di peptide grande e biblioteche di proteina nel superficie del |phage| filamentoso. Phage espone le biblioteche permettono la selezione di peptide e proteine, anticorpi di inclusione, con alta affinità e specificità per quasi alcune obiettivo. un vantaggio cruciale di questa tecnologia è il collegamento diretto che esista tra il fenotipo sperimentale ed i suoi incapsulò il genotipo, che permette l'evoluzione delle persona che lega selezionate nelle molecole ottimizzate. La mostra di Phage facilita l'ingegneria di anticorpi a proposito della loro taglia, valenza, affinità, e funzioni di effettore. La selezione di anticorpi e peptide da biblioteche esposte nel superficie del |phage| filamentoso ha significativo provato per l'isolamento di routine di peptide ed anticorpi per domande diagnostiche e terapeutiche. Questa visualizzazione serve come un'introduzione a mostra di |phage| , ingegneria di anticorpo, lo sviluppo di di |phage| esposto peptide e frammenti di anticorpo in reagenti diagnostici vitali, ed i trend recenti nella tecnologia di mostra. 2002 La società canadese dei chimici clinici. Tutti i diritti riservati.
Parole chiavi: Mostra di Phage; I frammenti variabili della catena singola; Peptide di Phage; Diagnostica di Immuno; Gli anticorpi ricombinanti; Panoramica; Anticorpi di Bispecific
Indici
Veduta d'insieme e prospettive
1.1. Introduzione
1.2. Filamentoso Phage
1.2.1. Struttura
1.2.2. Ciclo vitale
1.2.3. Vettori di Phagemid Cloning
1.3. La molecola di anticorpo: un sinossi
1.3.1. Struttura
1.3.2. I meccanismi responsabile per la diversità di luoghi di rilegatura di antigene
1.3.3. Frammenti di anticorpo
2 Costruzione e schermatura di biblioteche di anticorpo di Phage esposto:
2.1. La costruzione delle biblioteche di scFv Phage Display
2.2. I tipi di repertori di anticorpo
2.2.1. Na?¨repertori di |ve|: "La singola spara le biblioteche"
2.2.2. I repertori immuni
L'autore corrispondente. University of Maryland School della medicina, 10 S. Pine Street, Rm 7-56, Baltimore, MD 21201. Tel.: ?410-706-7011; facsimile: ?410-706-8414.
E-indirizzo di posta: [email]
[email protected][/email] (H.M.E. Azzazy).
2.2.3. I repertori sintetici
2.3. La selezione di biblioteche di anticorpo: "Panoramica di biografia"
2.3.1. La selezione usando gli antigeni immobilizzati
2.3.2. La selezione che usa antigeni nella soluzione
2.3.3. La selezione in celli
2.3.4. La selezione in vivo
2.3.5. Commenti
2.4. La produzione delle molecole di scFv solubili
Migliorare l'affinità dell'anticorpo di |phage| si frammenta
3.1. Multimer Formation: Migliorare l'avidità di scFv si frammenta
3.2. La maturazione di affinità per il mutagenesi di Site diretto
3.3. La maturazione di affinità per Chain Shuffling
2 Le domande diagnostiche in vitro di Phage Display
4.1. Le domande generali
4.1.1. Domande di peptide di Phage:
4.1.1.1. La mostra di Phage delle peptide casuali
4.1.1.2. |epitopes| di anticorpo di rilevamento
4.1.1.3. Gli immunogeni generanti
4.1.2. Domande di anticorpo di Phage:
4.1.2.1. L'isolamento di anticorpi di alta affinità
0009-9120/02/$- veda la questione anteriore 2002 La società canadese dei chimici clinici. Tutti i diritti riservati. PII: S0009-9120 (02) 00343-0
H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445
4.1.2.2. Gli anticorpi catalitici
4.1.3. Diriga l'evoluzione di proteini
4.1.4. Enzimi di Phage
4.2. La produzione dei reagenti diagnostici per scoperta di passo singolo di antigeni di obiettivo: Genetico Fu¬il |sion| dell'anticorpo si frammenta a Reporter Mole¬|cules|
4.2.1. pro di fusione di fosfatasi di ScFv alcalino¬|tein|
4.2.2. Fluobodies
4.3. una strategia di tre passi per la caratterizzazione di umano Sera per la peptide di Phage esposto Librar¬[...]
4.3.1. La selezione di affinità delle biblioteche di peptide casuali di Phage esposto
4.3.2. Filtri la schermatura di Immuno dell'affinità Se¬il |lected| Phage
4.3.3. La schermatura contraria con Negative Sera
5. Selezioni le domande terapeutiche di Phage Display
5.1. Gli anticorpi di scFv ricombinanti con attività contro-tumori
5.2. L'inibizione di Prion Propagation che usa gli anticorpi favolosi
6. Le innovazioni recenti nella tecnologia di mostra
6.1. Selettivamente infettivo Phage (sorso)
6.2. Pianificare gli anticorpi di Bispecific
6.3. Biblioteche di Phage di panorama
6.4. Mostra di ribosoma
2 Conclusioni
Referenzi
Veduta d'insieme e prospettive
1.1. Introduzione
Phage espone, il primo presentato per G. Smith in 1985 1, è un modo molto effettivo per produrre numeri grandi ( fino a 1010 ) di peptide diverse e proteini ed isolando la talpa¬i |cules| che compiono le funzioni specifiche ( per le visualizzazioni veda 2-10). Questa tecnica si può usarsi anche a studiare le interazioni di legante di proteina 11 , recettore e rilegatura di anticorpo situano 3,4, ed a migliorare o cambiare l'affinità di proteini per i loro partner impegnativi 5,7. La mostra di Phage coinvolge i |expres|¬il |sion| di proteine, includendo gli anticorpi, o le peptide nel superficie del |phage| filamentoso. sequenze di DNA dell'interesse si inseriscono in un'ubicazione nella genoma di |bac| filamentoso¬|teriophage| tale che la proteina codificata si esprime o " espose " nel superficie del |phage| filamentoso come un prodotto di fusione ad uno del |phage| rivestono le proteine (Figure 1). Là¬la parte anteriore, invece di dovere pianificare geneticamente proteini o varianti di peptide un-per-un ed allora esprima, purifichi si, ed analizzi ogni il |phage|, vario espone le biblioteche contenendo
Fico 1. Il diagramma schematico di un |phage| filamentoso che espone la singola incatena il frammento variabile (scFv) le molecole. Il |phage| consista di circolare SsDNA circondato per una proteina di giacca. g8p (pVIII) è la proteina di giacca maggiore mentre G3p, alla punta del |phage|, sono uno delle proteine di giacca minori. I geni che codificano i domini variabili dello ScFv ed un collegamento si mune di miccia a gene III (g3) nella genoma del |phage| filamentoso. Di conseguenza, lo scFv si espone come una fusione a g3p (pIII) la proteina alla punta del |phage|. In realtà, lo scFv non si mune di miccia a tutte le molecole di proteina di g3p, e perciò il |phage| trattiene la sua abilità ad infettare il |bacteria|. Quattro molecole di g3p si illustrano nella figura, tre di che espongono le molecole di scFv.
diverso bilione varianti si può costruire simultaneamente. Queste biblioteche poi possono essere facilmente usato a selezionare e purificare sequenze che porta specifiche di particelle di |phage| con le specificità di rilegatura desiderati dai varianti nonbinding.
Due scoperte importanti erano essenziale per lo sviluppo di |phage| di anticorpo esponga la tecnologia. Primo, il |demonstra|¬
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il |tion| che il DNA straniero inserí nel gene di |phage| filamentoso III (g3) si esprime come una proteina di fusione ed espose nel superficie del |phage| 1. Assecondare, l'espressione riuscita dell'anticorpo funzionale si frammenta nello spazio di |periplasmic| di
E. il |coli| 12,13.
un aspetto significativo della mostra di |phage| partora collegando il fenotipo di alcune peptide o proteina di batteriofago esposto con il genotipo codificando quella molecola, pacco dentro la stessa virione. Questa permette la selezione ed amplificazione dei cloni specifici del |phage| rappresentando desiderò legando le sequenze dalle piscine di bilioni di cloni di |phage|. In caso di |phage| filamentoso, l'amplificazione è semplicemente compiuta infettando il |coli| di E. maschio. Il collegamento di fenotipo di genotipo anche permette la determinazione rapida della sequenza di amminoacido della molecola di peptide o proteina impegnativa specifica per l'ordinamento di DNA dell'inserto specifico nella genoma di |phage|.
I tentativi si facevano a trovare i metodi di mostra alternativi tale come la mostra sui superficie batterici 14, il fermento fanno affiorare 15, o direttamente nel DNA di plasmidio di codificare ( le peptide¬la biblioteca su plasmidi; 16). Comunque, come tutti questi sistemi comportano ancora la trasformazione di un oste cellulare, loro non hanno il |suc|¬il |ceeded| stare generare le biblioteche di diversità grandi.
Questa visualizzazione, sebbene non comprensivo a proposito degli ammontari impressionanti di |phage| esponga il lavoro diede una rappresentazione sulla decade passata, focalizzano per principio del |phage| esponga tecnologia, i metodi per la costruzione e panoramica di biografia di biblioteche, tipi di anticorpo di |phage| di repertori di anticorpo, e gli approcci diversi a migliorare l'affinità di |recom|¬anticorpi di |binant|. Accentua anche le domande diagnostiche in vitro dei peptide ed anticorpi di |phage| esposto, selezionò le domande terapeutiche di anticorpi ricombinanti e trend recenti nel |phage| espongono la tecnologia.
1.2. Il |phage| filamentoso
1.2.1. Struttura
I batteriofagi, o semplicemente |phages|, sono i virus che infettano una varietà del |bacteria| gram-negativo che usano il |pili| come i recettori. Le particelle di |phage| filamentose di Ff ( tendono M13, f1 e |fd| ), quello infetti il |coli| di E. via |pili| di F, consista di un arenato singolo (|ss|) il DNA che è racchiuso in una giacca di proteina. La genoma intera del |phage| consiste di 11 geni. un |phage| vitale esprime su 2700 copie di 8 proteina di gene ( g8p o pVIII, un 50 proteina di residuo di |aa| che è anche conosciuto con il nome della proteina di capside maggiore ) e da 3 a 5 copie del gene III (g3) la proteina di adsorbimento di -encoded ( g3p o pIII, un 406 proteina di |aa| che è uno di tre proteine di giacca minori del |phage| filamentoso )in la sua punta( figura 1 ) ( per la visualizzazione veda 17 ).
1.2.2. Ciclo vitale
Il |phage| filamentoso non produce un'infezione di in
E. |coli|, ma piuttosto inciti uno stato in che il |bacteria| infetto produce e cela le particelle di |phage| senza sotto¬il lisi bene avviato. L'infezione si inizia per l'attaccamento del |phage| G3p ai |pilus| di |f| di un |coli| di E. maschio ( e.g., E. il |coli| TG1 ). Solo il |phage| circolare ssDNA entra il batterio dove esso si converte per l'apparato di risposta di DNA di oste nel plasmidio arenato duplice piace del |replicative| forma (RF). Il RF subisce la risposta di cerchio rotolante a fare ssDNA ed anche servono come una maschera per l'espressione del pro di |phage|¬i |teins| g3p e g8p. Il progenie di Phage si assembla per il pacco¬fare invecchiare di ssDNA nella proteina riveste ed estruse attraverso la membrana batterica nel mezzo.
Il |phage| riveste le proteine g3p e g8p sono complicati nella clonazione e scoperta degli anticorpi e peptide del |phage| ricombinanti. Gli anticorpi ricombinanti, e piegò proteini, è espresso tipicamente come proteine di fusione di g3p ed esponga si alla punta del |phage| di M13. Quando questi anticorpi si incastrano all'antigene il |phage| di confine si scopre con un HRP-identificò l'anticorpo ( Amersham Pharmacia Biotech; Uppsala, la Svezia ) quello riconosca la proteina di giacca di g8p. Da diverso mille copie di g8p esista nel superficie di |phage| , lo |effec|¬la |tively| amplifica il segnale di scoperta. D'altra parte, le peptide si possono esporre come le fusioni ad o g3p o g8p. Se le peptide si munissero di miccia a G8p, limiti il |phage| si può scoprire usando gli anticorpi monoclonali del ratto che riconoscono un |epitope| localizzò nella porzione di N finale di g3p 18.
1.2.3. Phagemid clonando i vettori
Con il |phage| di M13 , ci ha due formi del DNA di |phage|: le maschere di ssDNA che possono essere facilmente preparato da media di |phage| ed usò per ordinare in sequenza; e DsDNA ( i |plas|¬medio-come il RF ) quello potere isolare dall'oste batterico infetto ed usò per clonare di un frammento di obiettivo. Phagemids, un vettore più popolare per mostra, sono gli ibridi di vettori di |phage| e plasmidio. Phagemids si progettano per contenere le origini di risposti per entrambi il |phage| di M13 e |coli| di E. in più di gene III, appropriano i luoghi di clonazione multipli, ed un gene di resistenza antibiotica 19. Comunque, mancano tutto altri prodotti di gene strutturali e nonstructural richiesti per generare un |phage| completo. Phagemids si possono crescere tanto plasmidi o alternativamente pacco come il |phage| di M13 ricombinante con l'aiuto di un |phage| di aiutante che contiene un'origine leggermente difettosa della risposta (tale come M13KO7 o VCSM13) ed approvvigionamenti, in |trans|, tutte le proteine strutturali richieste per generare un |phage| completo. Questo processo si chiama la "liberazione di |phage|". Le particelle di |phage| di risultare possono incorporarsi PIII dedotto dal |phage| di aiutante o la proteina di fusione di pIII di polipeptide, codificato per il |phagemid|. I rapporti della proteina di fusione di pIII di polipeptide: il tipo selvatico PIII potere variare tra 1:9 e 1:1000 dipendendo nel tipo di |phagemid| , condizioni di crescita, la natura della polipeptide saltò a pIII, e la fenditura proteolitica del |fu| di pIII di anticorpo¬|sions|.
Il sistema di vettore di |phagemid| abilita l'accoppiamento della selezione di affinità (basati sui repertori esposti di peptide o frammenti di anticorpo) al ricupero del gene pacco che codifica quelle peptide o anticorpo. Sebbene questo sistema impone poche limitazioni tale come cancellatura di gene ed instabilità di plasmidio, esso è con successo usato isolare i frammenti di anticorpo contro una vasta gamma di proteine, DNA, i marcatori, virus e parassiti del superficie di cella. Vettori di Phagemid permette anche o la mostra condizionale dell'anticorpo su |phage| o l'occultamento dell'anticorpo nello spazio di |periplasmic| di |coli| di E. in un form che potere essere facilmente scoperto, e.g., per ELISA.
1.3. La molecola di anticorpo: un sinossi
1.3.1. Struttura
La comprensione di basic della struttura di anticorpo è necessario per la clonazione riuscita di geni di anticorpo. Tutti anticorpi hanno una struttura di base consistere di un paio identico di polipeptidi di catena pesanti ed un paio della luce identica incatena le polipeptidi tenne insieme per ponti di disolfuro e |nonco|¬il |valent| collega ( per una visualizzazione veda 20 ). Ognuno delle catene pesanti si codifica per vicino: variabile (VH), la diversità (D), congiungendo (JH), e continuo (CH) gli intervalli genetici; mentre ognuno delle catene leggere si codifica per per VL, JL, e cl intervalli. Il DNA e le sequenze di amminoacido della regione di C sono relativamente conservato dentro uno specie dato mentre quei della v regione è il dipendente di antigene. Appaiare delle regioni di v-d j pesanti di catena ed accendono le regioni di v j della catena crea un contro¬la rilegatura di informazioni situa (|paratope|) che riconosce una singola contro¬il determinante genico (|epitope|). Ogni v regione consiste di una struttura di avvisendare (FW) , che è conservò più, e tre di pubblicitario variabile o determinare di complementarità con riferimento a¬i |gions| (CDRs) con grande ordini in sequenza la diversità. Il CDRs, ed ad un'estensione minore le regioni di FW, interaga con l'antigene a formare il centro di un luogo di rilegatura di antigene. Il primo 2 CDRs codifichi si durante il v segmenti mentre il terzo CDR è il prodotto del congiungimento di di v-d j per il cattivo incateni o di v j per la catena leggera. Questa conoscenza della struttura di anticorpo ha facilitato la creazione di molecole di anticorpo completamente esterno il loro oste naturale.
1.3.2. I meccanismi responsabile per la diversità di luoghi di rilegatura di antigene
Un numero enorme degli anticorpi diversi si può generare per il sistema immunitario, ognuno ha un luogo di rilegatura di antigene unico (|paratope|) generato per i domini di N finale delle catene pesanti e leggere. Diversi meccanismi sono responsabile per la diversità dei |paratopes| 21: (i) una diversità recombinatorial: creato dalla selezione casuale di un gene di catena pesante variabile (VH), un gene di diversità (D) ed un cattivo congiungendo (JH) |minigene|, o una luce variabile incatena il gene (vl) ed una congiunzione leggera (JL) l'intervallo di gene fuori una piscina, a costituire il VH e VL domini, |respec|¬|tively|; (II) una diversità congiungimenta: appeso per i meccanismi di congiunzione imprecisi e per cancellatura o somma delle nucleotidi casuali ai contorni dei |minigenes| di VH di d jh di ricombinare; e (iii) una diversità combinatoria: generato per la riunione del VH e vl domini. Altri meccanismi includono: (i) l'ingrandimento dell'architettura del |paratope| aggiustando l'angolo tra il VH associato e vl domini; e (II) la maturazione specifica del |paratope| causata per un |hypermutation| somatico che migliora la complementarità di forma dell'anticorpo con l'antigene. Il cu-
Proponga 1 caratteristiche dell'anticorpo si frammentano
L'anticorpo mette in ordine di grandezza Paratopes Structure Fragment (kDa) (valenza)
ScFv 25-30 1 il vl domini di VHand si collega per un 15 |aa| si collega. Cambiare la lunghezza di collegamento dirige la formazione di |diabodies| ( 60 KDa ), |triabodies| ( 90 KDa ) o |tetrabodies| ( 120 KDa )
Fv 25 1 VH e VL senza il collegamento tra il v domini
Minibody 80 2 una proteina di fusione di scFv-CH3 che auto- assembles in un dimero bivalente di 80 KDa
Favoloso 50 1 composto di due chains:VH-CH1 e vl-cl
il F ( il |ab|?)2 100 2 Due molecole favolose
150 2 molecola di anticorpo di genitore di IgG: due cattivo incatena ( VH-CH1-CH2-CH3 ) e due luce incatena (vl-cl)
effetti di |mulative| di questi meccanismi determinano il contro¬genica affinità e specificità di un anticorpo.
1.3.3. Frammenti di anticorpo
Le molecole di anticorpo contengono i domini di proteina distinti che si possono separare per digestione di proteasi o prodotto per la tecnologia ricombinante. Due rilegatura di antigene si frammenta designò favoloso e Fv sia clonato ed espose nel |phage|. I favolosi più grandi (anticorpo di frammento) consiste di CH di VH e vl-cl intervalli collegato per gli obbligazioni di disolfuro. I più piccoli Fv ( frammenti variabile ) è composto del VL e regioni di VH solo. La versione ricombinante del Fv si chiama il frammento variabile di catena singola (scFv). Le dui regioni variabili nello scFv sono congiunti artificialmente con un collegamento di peptide flessibile, di solito un 15 collegamento di |aa| è usato con la sequenza (Gly4Ser) 3, ed espresse come una catena di polipeptide singola. Il collegamento permette l'associazione del VH e VL a formare il legare di antigene il luogo. un sommario del carattere¬i |istics| dei frammenti di anticorpo diversi si presentano nella tavola
Le rappresentazioni schematiche del |mol| di immunoglobulina intatto¬|ecule| e diversi frammenti di anticorpo di |monomeric| sono pre¬il |sented| in figura 2.
Costruzione e schermatura delle biblioteche di anticorpo di |phage| esposto
2.1. La costruzione del |phage| di scFv espone le biblioteche
Uno delle domande più potenti di mostra di |phage| sono l'isolamento degli anticorpi ricombinanti con una specificità unica 3,4,7,8,22. In questo riguardo, |phage| esponga la tecnologia si può usare a: (i) generi anticorpi monoclonali umani o umanizzano gli anticorpi di topo, significativo per immunoterapia di cancro, (II) isola anticorpi umani da pazienti esposti a certi agenti patogeni virali a meglio sotto¬
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Fico 2. La struttura del G di immunoglobulina intatto (IgG) molecola, un |minibody|, ed anticorpo di |monomeric| si frammentano: Favoloso (frammento di anticorpo), Fv (il frammento variabile), e ScFv (la singola incatena il frammento variabile). I domini variabili di pesante (VH) ed accenda (vl) le catene si rappresenta per gli ovali di per iscritto, rispettivamente. Le regioni continue di pesante (CH1-3) ed accenda (cl) le catene si rappresenta per gli ovali ombreggiati e tratteggiati, rispettivamente. ABD? il dominio di antigene impegnativo (|paratope|).
stia in piedi la risposta immune durante infezione e come pro¬gli anticorpi di |tective| si generano, e (iii) delucida il |spec|¬il |ificity| di anticorpi di |autoimmune|. Entrambi il favoloso e ScFv esprima si nel superficie delle particelle virali di M13 senza la perdita apparente delle specificità ed affinità dell'anticorpo.
Per costruire una biblioteca di scFv usando mostra di |phage|, i geni del cattivo variabile (VH) e luce variabile (vl) le catene di anticorpi si preparano per la trascrizione inversa di mRNA esisté dalle linfociti di B. Il cattivo ed accenda i prodotti di gene di catena si amplificano ed assemblano in un gene singolo usando un DNA collega il frammento. L'assemblato scFv DNA frammenti si inserisca si in un vettore di |phagemid| ed il |phagemid| ricombinante presenti si nel |coli| di E. competente per trasformazione di CaCl2 o |electroporation|. Ligation e trasformazione batterica sono cruciale, come loro direttamente |influ|¬il |ence| la taglia della biblioteca. Phagemid-contenendo le celle batteriche sono adulte ed allora infette con un |phage| di aiutante (M13VCS o KO7) a produrre i |phages| ricombinanti che espongono l'anticorpo di scFv si frammenta come la fusione ad uno del |phage| riveste le proteine. una descrizione particolareggiata dei passi complicata nella costruzione di un repertorio di scFv immune che usa la mostra di |phage| è fare entrare figura 3. un sommario di |vari| diverso¬capaci considerò per costruire una biblioteca di anticorpo presenti si in tavola 2.
La taglia dei repertori di anticorpo è limitato a?108 cloni per l'efficienza di |transfection| di DNA nelle celle batteriche ( come descrisse sopra ). I repertori di anticorpo più grandi di
?1010 i cloni sono preparato 23 usando il processo di infezione combinatoria e la ricombinazione in vivo 24. In questo metodo, |bacteria| contenendo un repertorio del donatore? il cattivo incatena ( codificato in un |replicon| di plasmidio ) è infetto con un "accettante" accenda il repertorio di catena (in il |phage|). Le due catene sono ricombinati poi nello stesso |replicon| di |phage| dentro il batterio. Usare questo processo, |frag| di anticorpo¬i |ments| contro una serie di apteni ed antigeni, con il |affini|¬faccia combaciare la serie di |nanomolar|, sia esistito.
La qualità della biblioteca è importante per il suo |perfor|¬|mance|. Il collaudo di biblioteca si può realizzare per controllare i parametri seguenti: (i) il numero di cloni di cui |pha|¬i |gemids| contengono l'inserto di scFv, (II) il numero di cloni ex¬i |phages| incalzanti portando ScFv, e (iii) il numero di cloni esprimendo solubile ScFv. Questi parametri possono essere tassati per una varietà di metodi includere la schermatura di PCR del |indi|¬il |vidual| clona ( a scoprire la presenza dell'inserto di scFV ) , e
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metta il puntino sull'analisi di macchia ( a scoprire entrambi i |phages| esponendo ScFv e solubile ScFv prodotto per il protetto clonano ). I cloni positivi possono essere più lontano caratterizzato per DNA impronta digitale, usando un'enzima di restrizione di tagliatore frequente, del |ampli| di PCR¬il |fied| ScFv inserisce ed ordinamento di DNA.
2.2. I tipi di repertori di anticorpo
2.2.1. Na?¨repertori di |ve|: "la singola spara le biblioteche"
In questa strategia, v geni dall'IgM mRNA delle celle di B dei donatori umani unimmunized isoli si dai linfociti, midollo osseo del sangue periferici, celle di milza, o dai fonti animali. Dal |librar| di pentola singolo umano di di piccole dimensioni¬( 3? 107 l'anticorpo clona ), gli anticorpi è isolato contro antigeni "stranieri" ( e.g., bovina sieroalbumina e lisozima ), gli apteni ( di 2 |phenyloxazol|-5-un ), o " se stesso " contro¬gli informazioni ( tireoglobulina, il fattore di necrosi di tumore?) 25. L'affinità di questi anticorpi era simile quello visto nel |na|¨?la risposta immune primaria del |ve| ed era sufficientemente reattivo in macchia occidentale, ELISA, e l'analisi di facs 25.
un |na| di una certa statura grande¨?la biblioteca di |ve| si costruiva usando il |lym|¬i |phocytes| da su 40 nonimmunized donatori umani e contenne 1.4? 1010 i cloni 26. Gli anticorpi si isolavano da questa biblioteca contro tutti antigeni esaminati con le affinità (Ka) nella serie di |nanomolar| bassa, tipico per una risposta immune secondaria 26. Perciò, né l'immunizzazione né la maturazione di affinità è richiesto per generare la creatura umana contro¬corpi con l'affinità alta.
I vantaggi importanti di repertori di pentola singola includono: (i) |iso|¬il |lation| degli anticorpi umani a se stesso, |nonimmunogenic| o antigeni tossici; (II) una biblioteca singola può essere usato sebbene antigeni; (iii) l'orario ridotto ebbe bisogno per la generazione di anticorpo ( 2-4 i tondi della selezione in due settimane); e (iv) dirige l'isolamento degli anticorpi di affinità alti quando la reputazione molto grande¬i |toires| si usano. Gli svantaggi del |na|¨?le biblioteche di |ve| sono: (i) l'affinità bassa di anticorpi isolò dalle biblioteche di una certa statura piccole; (II) il tempo ebbe bisogno di costruire le biblioteche grandi, e (iii) contenta e la qualità della biblioteca influenzi si per i disuguali
Fico 3. Il diagramma schematico per costruire un repertorio di scFv immune che usa la mostra di |phage|. I rne totali sono primi isolò dalle celle di milza di linfociti di B ed allora mRNA è l'affinità purificata per il |chromatog| di affinità¬il |raphy| nel |oligo| (dT) -cellulose. mRNA è inverso trascrisse in CDNA usando i |hexamers| casuali. Il cattivo ed accendono i geni di anticorpo di catena si amplifica in due le reazioni separate usando due collezioni degli inneschi progettato per ibridarsi per fini opposti della regione variabile di ogni catena. Il cattivo purificato ed accenda i prodotti DNA di catena si riuniscono in un gene singolo usando un DNA collega il frammento costruí per ibridarsi al 3?-il fine del cattivo incatena ed il 5?-il fine della catena leggera. L'assemblato scFv DNA frammenti si amplifichi si per PCR usando una collezione degli inneschi progettato a presentare i luoghi di restrizione per la clonazione in un vettore di |phagemid|. Seguente digestione di restrizione e |ligation| del DNA di scFv al |phagemid| , il vettore di |ligated| si presenta nel |coli| di E. competente per trasformazione di CaCl2 o |electropora|¬|tion|. Phagemid-contenendo le celle batteriche sono adulte ed allora infette con un |phage| di aiutante (M13VCS o KO7), un processo conosciuto come liberazione di |phage|, a produrre i |phages| ricombinanti che esponga l'anticorpo di scFv si frammenta come la fusione ad uno del |phage| riveste le proteine.
H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 431
Proponga 2 variabili considerò in fare una biblioteca di anticorpo
I commenti variabili
Il fonte dei geni di dominio variabili e CDRs: Gli anticorpi di affinità alti a |immunogenic| o antigene di malattia collegata si possono isolare da un ) immune o immune di malattia collegata di biblioteca o |b| di biblioteche di malattia ) naturale o le biblioteche naturali sintetiche di biblioteche o sintetiche sono il fonte meglio per anticorpi a molti antigeni
L'amplificazione di geni di anticorpo per: - a) il |b| di PCR ) i |oligonucleotides| sintetici c ) la combinazione
La configurazione dell'esposto frammenti si: le molecole di ScFv hanno potenziale più alto a formare i |multimers| un )scFv Size( scFv:25 kDa, favoloso 50 KDa )|b|) la stabilità favolosa esce ( favoloso è più stabile )
Sistema di mostra: ? La mostra in molte copie usando la proteina di giacca maggiore G8p (pVIII), o in poche copie un ) Phage o mostra di |phagemid| usando il g3p usando la proteina di giacca minore G3p (pIII) (pIII) o g8p (pVIII)? Per la mostra multivalente usando il g8p (pVIII) , sarà più difficile selezionare
i cloni di affinità più alti
b) I sistemi di mostra cellulari: E. |coli| o fermento? I sistemi di Phagemid usando g3p (pIII) la mostra sono i più frequentemente usati come loro permettono la frequenza alta di mostra monovalente e conversione facile dall'anticorpo di |phage| esposto per anticorpo solubile
c) Mostra di ribosoma? Per sistemi di mostra cellulari, la selezione di cella si può usare ad arricchire i varianti di affinità
? La mostra di ribosoma offre un sistema di evoluzione molecolare libero di cella per anticorpi
l'espressione del repertorio di v geni, la storia ignota del donatore di cella di B, e potenziale la diversità limitato del repertorio di IgM.
2.2.2. Il repertorio immune
In questa biblioteca, v geni è derivato dall'IgG mRNA delle celle di B da un animale immunizzato o, in certi casi, creatura umana. Umanizzò i repertori immuni anche possono essere pre¬tagliò usando immunizzò i topi di |transgenic| (|xenomice|). Xe¬i |nomice| sono generato quello alberghi più del v geni di sistema immunitario umano nel |germline| (invece del repertorio immune native di |murine| ) 27. L'immunizzazione di questi topi con un aptene o alcuni risultati di antigene stranieri nella produzione degli anticorpi di uguale umano nelle loro celle di B. I geni di anticorpo si possono ristabilire dalle celle di B per PCR e selezione di biblioteca o per la fusione in una linea di cella monoclonale per la tecnologia di |hybridoma|.
Una biblioteca di anticorpo immune ha due carattere principale¬|istics|: (i) esso si arricchirà nel |antibod| di antigene specifico¬, e (II) alcuni di questi anticorpi avrà la maturazione di affinità di |undergone| per il sistema immunitario 13,28. Im¬le biblioteche di |mune| si usavano a produrre anticorpi contro l'antigene di |carcino| embrionale (CEA) 29, |recep| di cella di T¬il picco-v? 30 e laurei si il |histocompatibility| Complex/pep¬complessi di marea 31. Anticorpi di alta affinità erano con riferimento a¬la |portedly| dedotta dai topi 31, i polli 32, ed i conigli 33. Le biblioteche di anticorpo erano dedotti anche dalla pecora 34, atterriscono ed i primati nonhuman 35.
Gli svantaggi delle biblioteche immuni includono: (i) il tempo lungo richiede per immunizzazione animale, (II) la mancanza di im¬la risposta di |mune| a se stesso o antigeni tossici, (iii) gli unpri¬il |dictability| della risposta immune all'antigene di interesse, (iv) una nuova biblioteca di anticorpo si deve costruire per ogni antigene ( questo aumenta il tempo totale della procedura per 1-3 i mesi ) , e (v) restrizioni nell'informazioni¬gli anticorpi umani del |erating|.
una domanda unica delle biblioteche immuni deve clonare gli anticorpi di alta affinità presenti dopo infezioni virali o può¬|cer|, e gli anticorpi ad auto- antigeni presenti in pazienti con le malattie di |autoimmune|. L'analisi di tali anticorpi può aiutare nell'identificazione dei |epitopes| antigenici complicato nella risposta immune umorale. una seconda domanda delle biblioteche immuni coinvolge la rimozione di anticorpi irrilevanti; questo si può usare a generare anticorpi contro minore o poveramente antigeni di |immunogenic|. Gli animali si possono fare tollerante a certi antigeni poi immunizzi con una mistura dell'antigene attinente e gli irrilevanti. Questo approccio si usava ad isolare gli anticorpi di |antimelanoma| umani dalle biblioteche di |phage| dei malati di cancro immunizzate con il |tu| di |autologous|¬celle di |mor| 36.
2.2.3. I repertori sintetici
La specificità di alcune anticorpo risiiede nella sei complementarità determinando regioni (CDRs) che plasma l'antigene legando situano ( 3 CDRs su ognuno della luce pesante e variabile variabile incatenano ). Si diventava ovvio da studi strutturali che cinque del sei CDRs abbia limitato la variazione strutturale 37. Il CDR3 della catena pesante (VH-CDR3) è il cappio più diverso in composizione e lunghezza ( valutò la diversità potenziale di 1023 sequenze )
38 ed è più centrale al legare di antigene il luogo di tutto CDRs. Perciò, i repertori sintetici possono essere fatti casualizzando la regione di VH-CDR3 usare mutagenesi di |oligonucleotide| diretto o le tecniche di base a PCR. Diversi repertori sintetici si facevano usando le stratege diverse che includono l'uso di casualizzò accenda si e la catena pesante CDR3s 39 e divereficando tutto tre CDR fa in un intervallo di v geni 40. un vantaggio maggiore dei repertori sintetici sul |na|¨?il |ve| uno sono i potenziali a controllare e definire i contenuti, variabilità locale e diversità complessiva delle biblioteche sintetiche.
2.3. La selezione di biblioteche di anticorpo: "panoramica di biografia"
Le biblioteche di anticorpo si proteggono ed arricchí per cloni di antigene specifico per una tecnica conosciuta come la panoramica di biografia in che i |phages| esponendo scFv si sta in incubatrice con un |immo|¬l'antigene di |bilized| dell'interesse 25,28. I |phages| slegati si rimuovono lavando mentre |phages| esponendo ScFv che leghi specificamente l'antigene si elue, cambiando le condizioni di rilegatura, ed amplificò nel |coli| di E.. Questo ciclo di selezione si illustra in figura 4. Idealmente, solo un ciclo della selezione dovrebbe essere richiesto, comunque la rilegatura di non¬il |phage| specifico limita l'arricchimento che può essere realizzato per ciclo. In pratica, diversi tondi della selezione sono il |nec|¬il |essary| ( medi 2-4 i cicli ). Diverso |strate| di panoramica di biografia¬i |gies| (Figure 5) si discutono sotto.
2.3.1. La selezione usando gli antigeni immobilizzati
Le biblioteche di Phage si selezionano fluendo attraverso un |affin|¬la colonna di |ity| con l'antigene immobilizzato dell'interesse 28,41. Seguire la lavatura della colonna a rimuovere cloni nonspecific, le persona che lega specifiche si eluono ed amplificano nel |coli| di E.. La selezione si può darsi una rappresentazione anche contro antigene adsorbito sui superficie plastici tale come i |immunotubes| ( i tubi di Maxisorb; Nalge Nunc Intl., Naperville, IL ) o il |immu| di enzima collegata¬il |nosorbent| saggia (ELISA) placchi 42,43. Alternativamente, un¬il |tigen| si può immobilizzare nei microcircuiti dei sensori di BIAcore 44.
Esso dovrebbe essere celebre quella selezione del metodo di immobilizzazione deve il prendere nella considerazione l'integrità conformazionale dell'antigene immobilizzato. Alcuno |antibod| di |phage|¬selezionammo contro un antigene adsorbito potere potere riconoscere il nativo forma dell'antigene. Un modo al |cir|¬il |cumvent| tale problema deve assumere il rivestimento di antigene indiretto attraverso l'uso degli anticorpi di cattura di antigene specifico 45.
Gli anticorpi di |phage| esposto specifici si possono eluire dai loro antigeni specifici con le soluzioni silicee ( tale come HCl o buffer di glicina ) 43,46 , con soluzioni di base tale come il |trieth|¬il |ylamine| 42, per la fenditura di |enzymatic| di un luogo di proteasi costruita tra l'anticorpo e g3p 47 , o per il |com|¬la petizione con l'antigene di eccedenza 28.
2.3.2. La selezione che usa antigeni nella soluzione
Questa tecnica permette la soluzione legando e superano problemi con i cambi conformazionali che sono incontrati su rivestire antigeni nei superficie solidi. L'uso di identificò gli antigeni solubili permettono anche una quantificazione più accurata dell'antigene usata durante la selezione 48 e di conseguenza migliori l'abilità ad usare abbassa concentrazioni dell'antigene a favorire la selezione di anticorpi di |phage| di alta affinità. Seguire l'incubazione degli anticorpi di |phage| con antigene di |biotinylated|, il |phage| balzi all'antigene identificato ristabilisca si con |avidin| o perline paramagnetiche di |streptavidin| rivestito. Spe¬i |phages| di |cific| sono dissociati poi dall'antigene e salmerino¬|acterized|. Alcuni svantaggi di questa tecnica sono quello contro¬anticorpi di |streptavidin| si isoleranno. Comunque, questo problema può essere risoluto per un passo di sfruttamento eccessivo usando il |strepta|¬di |vidin| rivestito munono di grani.
2.3.3. La selezione in celli
Diriga la selezione di anticorpi contro marcatori nei superficie di cella può essere effettuare nell'uno o l'altro |monolayers| del |adher|¬celle di |ent| o in celli nella sospensione. Il |phage| slegato si può lavare via sciacquando i fiaschi di cultura di tessuto (|monolayers|) o |centrifugation| (sospensione di cella). Ad ottimizzare il |isola|¬il |tion| delle persona che lega di antigene specifico e minimizzi la rilegatura di persona che lega irrilevanti, una selezione positiva simultanea e negativa si può applicare a 49. In questo approccio, un |compe|¬il |tition| si innalza tra un numero piccolo di celle di obiettivo di antigene positivo ed un'eccedenza di celle di "assorbitore" di negativo di antigene a legare gli anticorpi della biblioteca di |phage|; le celle di assorbitore servono come un lavandino per l'aderenza nonspecific delle persona che lega irrilevanti. un anticorpo fluorescentemente identificato contro un |irrele|¬l'antigene di |vant| presenta solo nelle celle di obiettivo aggiunga si e FACS si usa ad isolare le celle di obiettivo che legano gli anticorpi di |phage| specifici. Usare una tecnica simile ed alcuni ricercatori di biblioteca favolosi isolarono diverso contro-Rh (D) il |antibod| favoloso¬del significato clinico 50. Gli approcci simili si possono utilizzare ad identificare antigeni di tumore specifico putativi ed in pro¬il |vide| un approccio di prodotto alto rapido per isolare auto- replica¬l'anticorpo di |tive| si frammenta diresse contro romanzo o |conforma|¬la cella di dipendente di |tionally| affiora i marcatori. Un altro gruppo sottopose una biblioteca di scFv a tre tondi della selezione positiva in celle di melanoma umane e selezione negativa su celle mononucleate periferiche umane di sangue 51. Due cloni di scFv si isolavano che riconoscono le celle di melanoma in ELISA e . Le selezioni anche possono essere effettuare nelle sezioni di tessuto così come i tessuti interi.
2.3.4. La selezione in vivo
In questi repertori di |phage| di metodo è iniettato direttamente negli animali ed allora tessuti raccolga ed esamini per il confine di |phage| per |endothelial| di tessuto specifico i marcatori di cella come faccia una dimostrazione per il |phage| di peptide 52. Pasqualini e Ruoslahti 52 erano il primo ad isolare le peptide di |phage| esposto che la casa per letti vascolari selettivi in vivo. La panoramica in vivo ha diversi vantaggi: (i) i |dis| di |phage| isolati¬la casa di peptide giocata selettivamente agli obiettivi "intatti" di in¬|terest|; (II) un passo di bloccare inerente si include dove più delle peptide di |phage| esposto che riconoscono plasma onnipresente e cella affiorano le proteine si eliminano; (iii) queste peptide può essere utile per l'analisi funzionale di nuovi recettori ed identificazione potenziale del romanzo drogano candidati di obiettivo perché parte delle peptide isolate è fondi per legare a recettori di |endothelial| espresse nel |vasculature| dei tessuti specifici.
2.3.5. Commenti
Molti laboratori hanno esperimentato difficoltà pratiche con proteggere le biblioteche di |phage|. Ad esempio, la panoramica di
H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 433
Fico 4. La panoramica di biografia della biblioteca di mostra di |phage|. La biblioteca si protegge in quattro passi: (1) la rilegatura dei |phages| all'antigene di obiettivo ( in questo caso l'antigene immobilizzò in un appoggio solido ), (2) lavando a rimuovere |phage| slegato, (3) la dissociazione a recuperare il |phage| di antigene specifico, e (4) l'amplificazione del |phage| di antigene specifico per l'infezione del |coli| di E.. La cautela si deve esercitare durante i passi impegnativi e di lavatura ad evitare forza ionica bassa o altre condizioni che possono favorire l'adsorbimento del |phage| direttamente su plastico o altra matrice.
Fico 5. Gli approcci diversi per la panoramica di biblioteche di |phage|. Colle di antigene¬|umns|: le biblioteche di |phage| si possono selezionare per fluire la biblioteca attraverso una colonna con l'antigene immobilizzato. Gli antigeni ricoperti: le biblioteche di |phage| si possono selezionare su antigene adsorbito nel superficie plastico. La selezione che usa il |biotinyl|¬in antigeni nella soluzione: questo metodo si usa <a> evadere il cambio conformazionale dell'antigene che accade durante rivestire. Balzi ed i |phages| slegati si separano usando le perline magnetiche di |avidin| rivestito. La selezione in celli: dia una rappresentazione direttamente nei |monolayers| delle celle o in celli nella sospensione; i |phages| slegati si rimuovono per domano risciacquatura o |centrifugation|. La selezione in vivo: in queste biblioteche di |phage| di metodo è iniettato direttamente negli animali ed allora tessuti raccolga ed esamini per il confine di |phage| agli antigeni di tessuto specifico.
le biblioteche di anticorpo soffrono da fallire per arricchire per anticorpi specifici e ricupero di anticorpi bassi in affinità soli. La perdita selettiva dei |phages| di alta affinità durante i cicli di selezione si può correggere per aumentare la severità dell'eluizione di |phage| dall'antigene di obiettivo. D'altra parte, esaminare il gene di anticorpo inserisce la taglia nei |phagemids| è¬il due panoramica di |tween| va in bicicletta indicò che la frazione di |phages| con l'inserto in grandezza naturale decresciuto durante l'amplificazione 53. Phages con l'inserto più piccolo ( di solito perdendo la regione di VH ) tendono a coprire i |phages| con inserti in grandezza naturale nelle culture mescolate. Questo si può abolire scegliendo un certo numero di |phagemid| individuale clonano (con inserti in grandezza naturale) dopo le culture pure ultime di ciclo di panoramica e miscela per un anticorpo di "|polyclonal|". Perciò, aggiustare le procedure di eluizione e schermatura durante la selezione può determinare se |phages| di alta affinità si seleziona o scarta.
2.4. La produzione delle molecole di scFv solubili
Per produrre solubile ScFv, i |phages| di antigene positivo si usano ad infetti uno sforzo specifico del |coli| di E. ( e.g., E. il |coli| HB2151 ) quello diriga la produzione di solubile ScFv. Tale
E. lo sforzo di |coli| si chiama le celle di "nonsuppressor" come loro |rec|¬il |ognize| un'ambra ferma codone, pianificò tra e g3 nel |phagemid|, ed unico espresso lo scFv senza la proteina di g3p. Il |phagemid| è anche designato presentare il cartellino di |polyhistidine| muní di miccia all'espresso ScFv, in tal modo permettendo la purificazione di proteina rapida e semplice per immobilizzò massicci la cromatografia di affinità. Dipendere sull'isolato cloni, gli anticorpi solubili possono essere presenti nella cultura surnatante, il |periplasm| batterico, And/or dentro le celle batteriche. Tutte tre frazioni si devono isolare ed analizzare in una macchia occidentale, usando un commercialmente disponibile il |antihistidine| coniugato ( il suo ) metta un'etichetta l'anticorpo, a determinare l'ubicazione degli anticorpi solubili. Solubile scFv è il rela¬|tively| semplice ad isolare, potere essere economicamente prodotto nel |bacteria| in quantità molto grandi 54,55, e non comportano le procedure refolding complesse 56.
3. Migliorare l'affinità dell'anticorpo di |phage| si frammenta
Sebbene gli anticorpi selezionarono da molto immune o biblioteche di pentola singola di una certa statura grande pari può essere estremamente uso¬il |ful| per gli scopi di ricerca in ELISA, le macchie occidentali, o im¬|munofluorescence|; la loro affinità non è spesso sufficiente per l'uso come i reagenti diagnostici sensibili.
La maturazione di affinità si può circonvenire facendo le molecole multivalenti 57; comunque, la stuoia di affinità in vitro¬il |uration| degli anticorpi selezionati si può richiedersi ancora in certi esempi. V-il gene incatena mescolando 28 e |mu| di luogo diretto¬i |tagenesis| sono usato per la maturazione di affinità delle molecole di scFv. Altri metodi per la casualizzazione di sequenze di proteina erano propagazione di inclusione anche applicata dei geni di scFv nel |mutator| di |coli| di E. tendono 58, il PCR di errore prono 48, ed il DNA che strascica 59.
3.1. Formazione di Multimer: migliorare l'avidità di scFv si frammenta
La molecola di scFv è su 30 KDa in taglia e consista OfaVH e vl domini impastoiò insieme via un collegamento di polipeptide ( di solito 15 residui di amminoacido ) quelli servizi ad im¬verifichi espressione ed efficienza piegamenta. una molecola di scFv è
H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 435
monovalente con un |paratope| funzionale singolo; di conseguenza esso ha l'avidità bassa. Usare un collegamento corto di 5 residui di amminoacido tra il VH e vl domini dello scFv era fondare a prevenire l'allineamento del v domini in un singolo scFv e faccia strada all'associazione di due molecole di scFv che forma un dimero chiamò un "|diabody|" 60,61. un |diabody|, con una taglia molecolare di su 60 KDa, è un dimero di scFv con due |paratopes| funzionali e più alta avidità che |frag| di scFv¬|ments|. Ridurre la lunghezza del collegamento a tre residui prevenne la formazione di dimeri di scFv ed invece diresse l'associazione di tre molecole di scFv a formare un assetto (un |triabody| di 90 kDa con tre |paratopes|) 61 and/or un |tetrava|¬presti |tetrabody| 62. Bispecificity può essere anche realizzato munendo di miccia due diverso scFv 63,64. Chiaramente, questo approccio permette il disegno di molecole impegnative multi-specifiche con scelto metta in ordine di grandezza e l'affinità funzionale.
3.2. La maturazione di affinità per il mutagenesi di luogo diretto
In questo metodo, gli amminoacidi di alcuni o più del CDRs si agisce come sostituto con residui diversi seguiti per la selezione di cloni con l'affinità più alta per l'antigene di obiettivo. una raffinatura di questo metodo " il |mu| parsimonioso¬i |tagenesis| " sviluppi si 65. In questa strategia, la sequenza di CDR intera di un frammento di anticorpo si protegge al |iden|¬gli amminoacidi di |tify| che sono attivamente complicati nell'antigene incastrando. Primo, il numero di codoni presentò limiti si tale che ogni amminoacido è unico programmò per per un codone singolo. Gli amminoacidi ad ogni posizione sono poi |manipu|¬in ritardo a favorire sequenze parentali, i cambi conservativi, e quei quello appaia più frequentemente nelle regioni di CDR dell'anticorpo. Perché il mutagenesi parsimonioso provvede in¬la formazione sulla contribuzione di amminoacidi distinti a legando e l'affinità, questo processo può essere usato come un iniziale intervenga la maturazione di affinità degli anticorpi ricombinanti.
3.3. La maturazione di affinità per la catena che strascica
Incateni mescolando provvedono modifichi al |af| intrinseco¬il |finity| di un monovalente specifico ScFv. In questo processo, la molecola di scFv fu soggetto ad un serie di manipolazioni in che il gene per una catena ( e.g., il VH ) della molecola di scFv cloni si in un repertorio per la seconda catena (vl) 66. La biblioteca di scFv di risultare conterrà il |phage| di scFv con VH incatenano specifico per l'antigene di obiettivo e vl catene casuale. La biblioteca si tegame contro l'antigene ad identificare cloni con le proprietà di rilegatura migliorate. Il nuovo vl gene è clonato poi in un repertorio di geni di VH. Per mantenere la specificità della molecola di scFv di genitore, il VH CDR3 ( quello contenga più dei residui di contatto all'antigene ) trattenga si senza cambi. Perciò, solo l'intervallo di VH da strutture 1 a 3, includendo il CDRs 1 e 2, sostituisca si. Usare questa strategia, l'affinità di un umano nonimmune ScFv che lega l'antigene di tumore di glicoproteina di c erbB-2 ( Kd? 1.6 ? 10?8 M), aumenti si sei volte ( Kd? 2.5 ? 10?9 M) per catena leggera che strascica e quintuplo ( Kd
Proponga 3 leganti di peptide di esempio selezionarono dalle biblioteche di Phage Display
Referenza di sequenza di peptide di proteina di obiettivo
La peptide di |natriuretic| atriale *MCHFGGRMDRISCYR 155
A di recettore
Concanavalin un MYWYPY 75
GPIIb/IIIa ?CNWKRGDC 156
Steptavidin AECHPQGPPCIEGRK 157
MSRPACPNDKYE di recettore di trombina 79
il TPO ( l'IEGPTLRQWLAARA di |thrombopoietin| umano 158
il recettore )
|compa|¬essere classificato a quei per anticorpi contro lo stesso pro di antigene¬il |duced| per i |hybridomas| 67.
4. Le domande diagnostiche in vitro della mostra di |phage|
4.1. Le domande generali
4.1.1. Domande di peptide di Phage
4.1.1.1. La mostra di Phage delle peptide casuali. Il |oligo| sintetico¬nucleotidi con una lunghezza continua ma con i codoni unspecified, casualizzò attraverso il mutagenesi di luogo diretto ci¬il |ing| degenera |oligodeoxynucleotides|, cloni si tanto le fusioni ad uno delle proteine di giacca del |phage| di M13 dove loro si esprimono come le proteine di fusione di capside di peptide. Le peptide di Phage portato esibono un potenziale di mimico largo al pilotaggio, lineare¬formazione ed i |epitopes| di |nonproteinaceous| 68,69. Queste biblioteche di peptide casuali si possono esaminare per incastrarsi a molecole di obiettivo dell'interesse (Table 3). La mostra di peptide casuali nel batteriofago filamentoso come la fusione ad o g3p o g8p rivestono proteine 1,70 -72 has allowed the identi¬fication of peptides that specifically bind to a variety of targets including antibodies 73, il |streptavidin| 74, |ribonu| ¬clease S 69, e |concanavalin| un 75.
