traduzione

lorenzo

traduzione

Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445
Review
Phage display technology: clinical applications and recent innovations
Hassan M. E. Azzazya,b,*, W. Edward Highsmith, Jra
aDepartment of Pathology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, USA
bDepartment of Medical & Research Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, USA

Abstract

Phage display is a molecular diversity technology that allows the presentation of large peptide and protein libraries on the surface of ﬁlamentous phage. Phage display libraries permit the selection of peptides and proteins, including antibodies, with high afﬁnity and speciﬁcity for almost any target. A crucial advantage of this technology is the direct link that exists between the experimental phenotype and its encapsulated genotype, which allows the evolution of the selected binders into optimized molecules. Phage display facilitates engineering of antibodies with regard to their size, valency, afﬁnity, and effector functions. The selection of antibodies and peptides from libraries displayed on the surface of ﬁlamentous phage has proven signiﬁcant for routine isolation of peptides and antibodies for diagnostic and therapeutic applications. This review serves as an introduction to phage display, antibody engineering, the development of phage-displayed peptides and antibody fragments into viable diagnostic reagents, and recent trends in display technology. 2002 The Canadian Society of Clinical Chemists. All rights reserved.
Keywords: Phage display; Single-chain variable fragments; Phage-peptide; Immuno-diagnostics; Recombinant antibodies; Panning; Bispeciﬁc antibodies

Table of Contents

Overview and Perspectives

1.1. Introduction
1.2. Filamentous Phage
1.2.1. Structure

1.2.2. Life Cycle
1.2.3. Phagemid Cloning Vectors
1.3. The Antibody Molecule: A Synopsis
1.3.1. Structure
1.3.2. Mechanisms Responsible for Diversity of Antigen-Binding Sites
1.3.3. Antibody Fragments
2 Construction and Screening of Phage-Displayed Antibody Libraries:

2.1. Construction of scFv Phage Display Libraries
2.2. Types of Antibody Repertoires
2.2.1. Naı¨ve Repertoires: ?Single Pot Libraries?
2.2.2. Immune Repertoires

Corresponding author. University of Maryland School of Medicine, 10 S. Pine Street, Rm 7-56, Baltimore, MD 21201. Tel.: �410-706-7011; fax: �410-706-8414.
E-mail address: [email][email protected][/email] (H.M.E. Azzazy).
2.2.3. Synthetic Repertoires
2.3. Selection of Antibody Libraries: ?Bio-panning?
2.3.1. Selection Using Immobilized Antigens
2.3.2. Selection Using Antigens in Solution
2.3.3. Selection on Cells
2.3.4. In vivo Selection
2.3.5. Remarks
2.4. Production of Soluble scFv Molecules
1. Improving afﬁnity of phage antibody fragments
  3.1. Multimer Formation: Enhancing the Avidity of scFv Fragments
  3.2. Afﬁnity Maturation by Site-Directed Mutagenesis
  3.3. Afﬁnity Maturation by Chain Shufﬂing
  2 In vitro Diagnostic Applications of Phage Display

4.1. General Applications
4.1.1. Phage-Peptide Applications:
4.1.1.1. Phage display of random peptides
4.1.1.2. Mapping antibody epitopes
4.1.1.3. Generating immunogens
4.1.2. Phage-Antibody Applications:
4.1.2.1. Isolation of high-afﬁnity Antibodies

0009-9120/02/$ ? see front matter 2002 The Canadian Society of Clinical Chemists. All rights reserved. PII: S0009-9120(02)00343-0
H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445

4.1.2.2. Catalytic antibodies
4.1.3. Directed Evolution of Proteins
4.1.4. Phage Enzymes
4.2. Production of Diagnostic Reagents for Single-Step Detection of Target Antigens: Genetic Fu¬sion of Antibody Fragments to Reporter Mole¬cules
4.2.1. ScFv-Alkaline Phosphatase Fusion Pro¬tein
4.2.2. Fluobodies
4.3. A Three-Step Strategy for Characterization of Human Sera by Phage-Displayed Peptide Librar¬ies
4.3.1. Afﬁnity Selection of Phage-Displayed Random Peptide Libraries
4.3.2. Filter Immuno-screening of Afﬁnity Se¬lected Phage
4.3.3. Counter-screening with Negative Sera
5. Selected Therapeutic Applications of Phage Display
5.1. Recombinant scFv Antibodies with Anti-Tumor Activities
5.2. Inhibition of Prion Propagation Using Fab Antibodies
6. Recent Innovations In Display Technology
6.1. Selectively Infective Phage (SIP)
6.2. Engineering Bispeciﬁc Antibodies
6.3. Landscape Phage Libraries
6.4. Ribosome Display
2 Conclusions
References

Overview and perspectives
1.1. Introduction
Phage display, ﬁrst introduced by G. Smith in 1985 [1], is a very effective way for producing large numbers (up to 1010) of diverse peptides and proteins and isolating mole¬cules that perform speciﬁc functions (for reviews see 2?10). This technique can also be used to study protein-ligand interactions [11], receptor and antibody-binding sites [3,4], and to improve or modify the afﬁnity of proteins for their binding partners [5,7]. Phage display involves the expres¬sion of proteins, including antibodies, or peptides on the surface of ﬁlamentous phage. DNA sequences of interest are inserted into a location in the genome of ﬁlamentous bac¬teriophage such that the encoded protein is expressed or ?displayed? on the surface of ﬁlamentous phage as a fusion product to one of the phage coat proteins (Figure 1). There¬fore, instead of having to genetically engineer proteins or peptide variants one-by-one and then express, purify, and analyze each variant, phage display libraries containing

Fig. 1. Schematic diagram of a ﬁlamentous phage displaying single chain variable fragment (scFv) molecules. The phage consists of circular ssDNA surrounded by a coat protein. g8p (pVIII) is the major coat protein whereas g3p, at the tip of the phage, is one of the minor coat proteins. The genes encoding the variable domains of the scFv and a linker are fused to gene III (g3) in the genome of the ﬁlamentous phage. Consequently, the scFv is displayed as a fusion to g3p (pIII) protein at the tip of the phage. In reality, the scFv is not fused to all g3p protein molecules, and therefore the phage retains its ability to infect bacteria. Four g3p molecules are illustrated in the ﬁgure, three of which display scFv molecules.
several billion variants can be constructed simultaneously. These libraries can then be easily used to select and purify speciﬁc phage particles bearing sequences with desired binding speciﬁcities from the nonbinding variants.
Two key discoveries were essential for the development of antibody phage display technology. First, the demonstra¬

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445 427

tion that foreign DNA inserted into ﬁlamentous phage gene III (g3) is expressed as a fusion protein and displayed on the surface of the phage [1]. Second, the successful expression of functional antibody fragments in the periplasmic space of
E. coli [12,13].
A signiﬁcant aspect of phage display lies in linking the phenotype of a bacteriophage-displayed peptide or protein with the genotype encoding that molecule, packaged within the same virion. This permits the selection and ampliﬁcation of speciﬁc clones of phage representing desired binding sequences from pools of billions of phage clones. In case of ﬁlamentous phage, ampliﬁcation is simply accomplished by infecting male E. coli. The genotype-phenotype linkage also permits the rapid determination of the amino acid sequence of the speciﬁc binding peptide or protein molecule by DNA sequencing of the speciﬁc insert in the phage genome.
Attempts were made to ﬁnd alternative display methods such as display on bacterial surfaces [14], yeast surfaces [15], or directly on the encoding plasmid DNA (peptides¬on-plasmids library; 16). However, as all these systems still entail transformation of a cellular host, they have not suc¬ceeded in generating large diversity libraries.
This review, although not comprehensive with regard to the impressive amounts of phage display work performed over the past decade, focuses on principles of phage display technology, methods for the construction and bio-panning of phage antibody libraries, types of antibody repertoires, and different approaches to enhance the afﬁnity of recom¬binant antibodies. It also highlights the in vitro diagnostic applications of phage-displayed peptides and antibodies, selected therapeutic applications of recombinant antibodies and recent trends in phage display technology.
1.2. Filamentous phage
1.2.1. Structure
Bacteriophages, or simply phages, are viruses that infect a variety of Gram-negative bacteria using pili as receptors. The Ff ﬁlamentous phage particles (strains M13, f1 and fd), that infect E. coli via F pili, consist of a single-stranded (ss) DNA that is enclosed in a protein coat. The entire genome of the phage consists of 11 genes. A viable phage expresses about 2700 copies of gene 8 protein (g8p or pVIII, a 50 aa residue protein that is also known as the major capsid protein) and 3 to 5 copies of the gene III (g3)-encoded adsorption protein (g3p or pIII, a 406 aa protein that is one of three minor coat proteins of the ﬁlamentous phage) on its tip (Figure 1) (for review see 17).
1.2.2. Life cycle
Filamentous phage does not produce a lytic infection in
E. coli, but rather induces a state in which the infected bacteria produce and secrete phage particles without under¬going lysis. Infection is initiated by the attachment of the phage g3p to the f pilus of a male E. coli (e.g., E. coli TG1). Only the circular phage ssDNA enters the bacterium where it is converted by the host DNA replication machinery into the double-stranded plasmid like replicative form (RF). The RF undergoes rolling circle replication to make ssDNA and also serves as a template for expression of the phage pro¬teins g3p and g8p. Phage progeny are assembled by pack¬aging of ssDNA into protein coats and extruded through the bacterial membrane into the medium.
The phage coat proteins g3p and g8p are involved in the cloning and detection of recombinant phage antibodies and peptides. Recombinant antibodies, and folded proteins, are typically expressed as g3p fusion proteins and are displayed at the tip of the M13 phage. When these antibodies bind to the antigen the bound phage is detected with an HRP-labeled antibody (Amersham Pharmacia Biotech; Uppsala, Sweden) that recognizes the g8p coat protein. Since several thousand copies of g8p exist on the phage surface, it effec¬tively ampliﬁes the detection signal. On the other hand, peptides may be displayed as fusions to either g3p or g8p. If peptides were fused to g8p, bound phage can be detected using rat monoclonal antibodies that recognize an epitope localized in the N-terminal portion of g3p [18].
1.2.3. Phagemid cloning vectors
With the M13 phage, there are two forms of the phage DNA: ssDNA templates that can be easily prepared from phage media and used for sequencing; and dsDNA (plas¬mid-like RF) that can be isolated from the infected bacterial host and used for cloning of a target fragment. Phagemids, a more popular vector for display, are hybrids of phage and plasmid vectors. Phagemids are designed to contain the origins of replications for both the M13 phage and E. coli in addition to gene III, appropriate multiple cloning sites, and an antibiotic-resistance gene [19]. However, they lack all other structural and nonstructural gene products required for generating a complete phage. Phagemids can be grown as plasmids or alternatively packaged as recombinant M13 phage with the aid of a helper phage that contains a slightly defective origin of replication (such as M13KO7 or VCSM13) and supplies, in trans, all the structural proteins required for generating a complete phage. This process is termed ?phage rescue?. The resulting phage particles may incorporate either pIII derived from the helper phage or the polypeptide-pIII fusion protein, encoded by the phagemid. The ratios of polypeptide-pIII fusion protein: wild type pIII may range between 1:9 and 1:1000 depending on the type of phagemid, growth conditions, the nature of the polypeptide fused to pIII, and proteolytic cleavage of antibody-pIII fu¬sions.
The phagemid vector system enables coupling of afﬁnity selection (based on the displayed repertoires of peptides or antibody fragments) to the recovery of the packaged gene encoding that peptide or antibody. Although this system imposes few limitations such as gene deletion and plasmid instability, it has been successfully used to isolate antibody fragments against a wide range of proteins, DNA, cell-surface markers, viruses and parasites. Phagemid vectors also allow either the conditional display of antibody on phage or the secretion of the antibody in the periplasmic space of E. coli in a form that can be easily detected, e.g., by ELISA.

1.3. The antibody molecule: a synopsis
1.3.1. Structure
Basic understanding of antibody structure is necessary for successful cloning of antibody genes. All antibodies have a basic structure consisting of an identical pair of heavy chain polypeptides and a pair of identical light chain polypeptides held together by disulﬁde bridges and nonco¬valent bonds (for a review see 20). Each of the heavy chains is encoded for by: variable (VH), diversity (D), joining (JH), and constant (CH) genetic segments; while each of the light chains is encoded for by VL, JL, and CL segments. The DNA and the amino acid sequences of the C region are relatively conserved within a given species while those of the V region are antigen-dependent. Pairing of the heavy chain V-D-J regions and light chain V-J regions creates an anti¬gen-binding site (paratope) which recognizes a single anti¬genic determinant (epitope). Each V region consists of an alternating framework (FW), which is more conserved, and three hyper-variable or complementarity-determining re¬gions (CDRs) with greatest sequence diversity. The CDRs, and to a lesser extent the FW regions, interact with the antigen to form the core of an antigen-binding site. The ﬁrst 2 CDRs are encoded by the V segment while the third CDR is the product of the junction of V-D-J for the heavy chain or V-J for the light chain. This knowledge of antibody structure has facilitated the creation of antibody molecules entirely outside their natural host.
1.3.2. Mechanisms responsible for diversity of antigen-binding sites
An enormous number of different antibodies can be generated by the immune system, each having a unique antigen-binding site (paratope) generated by the N-terminal domains of the heavy and light chains. Several mechanisms are responsible for the diversity of paratopes [21]: (i) a recombinatorial diversity: created by random selection of one variable heavy chain gene (VH), one diversity gene (D) and one heavy joining (JH) minigene, or one variable light chain gene (VL) and one light joining (JL) gene segment out of a pool, to constitute the VH and VL domains, respec¬tively; (ii) a junctional diversity: appended by the imprecise joining mechanisms and by deletion or addition of random nucleotides at the borders of the recombining VH-D-JH minigenes; and (iii) a combinatorial diversity: generated by the assembly of the VH and VL domains. Other mechanisms include: (i) enlargement of the architecture of the paratope by adjusting the angle between the associated VH and VL domains; and (ii) speciﬁc maturation of the paratope caused by a somatic hypermutation that improves the shape complementarity of the antibody with the antigen. The cu-
Table 1 Characteristics of Antibody Fragments
Antibody Size Paratopes Structure Fragment (kDa) (Valency)
ScFv 25?30 1 VHand VL domains are linked by a 15 aa linker. Changing the linker length directs the formation of diabodies (60 kDa), triabodies (90 kDa) or tetrabodies (120 kDa)
Fv 25 1 VH and VL with no linker between the V-domains
Minibody 80 2 An scFv-CH3 fusion protein that self-assembles into a bivalent dimer of 80 kDa
Fab 50 1 Composed of two chains:VH-CH1 and VL-CL
F(ab�)2 100 2 Two Fab molecules
IgG 150 2 Parent antibody molecule: two heavy chains (VH-CH1-CH2-CH3) and two light chains (VL-CL)
mulative effects of these mechanisms determine the anti¬genic afﬁnity and speciﬁcity of an antibody.
1.3.3. Antibody fragments
Antibody molecules contain discrete protein domains that can be separated by protease digestion or produced by recombinant technology. Two antigen-binding fragments designated Fab and Fv have been cloned and displayed on phage. The larger Fab (fragment antibody) consists of VH-CH and VL-CL segments linked by disulﬁde bonds. The smaller Fv (fragment variable) is composed of the VL and VH regions only. The recombinant version of the Fv is termed the single-chain variable fragment (scFv). The two variable regions in the scFv are artiﬁcially joined with a ﬂexible peptide linker, usually a 15 aa linker is used with the sequence (Gly4Ser)3, and expressed as a single polypeptide chain. The linker allows the association of the VH and VL to form the antigen-binding site. A summary of the character¬istics of different antibody fragments is presented in Table

Schematic representations of intact immunoglobulin mol¬ecule and several monomeric antibody fragments are pre¬sented in Figure 2.
Construction and screening of phage-displayed antibody libraries
2.1. Construction of scFv phage display libraries
One of the most powerful applications of phage display has been the isolation of recombinant antibodies with a unique speciﬁcity [3,4,7,8,22]. In this regard, phage display technology can be used to: (i) generate human monoclonal antibodies or humanize mouse antibodies, signiﬁcant for cancer immunotherapy, (ii) isolate human antibodies from patients exposed to certain viral pathogens to better under¬

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445 429

Fig. 2. Structure of intact immunoglobulin G (IgG) molecule, a minibody, and monomeric antibody fragments: Fab (antibody fragment), Fv (variable fragment), and scFv (single chain variable fragment). Variable domains of heavy (VH) and light (VL) chains are represented by black and white ovals, respectively. Constant regions of heavy (CH1-3) and light (CL) chains are represented by shaded and dotted ovals, respectively. ABD � antigen-binding domain (paratope).

stand the immune response during infection and how pro¬tective antibodies are generated, and (iii) elucidate the spec¬iﬁcity of autoimmune antibodies. Both Fab and scFv were expressed on the surface of M13 viral particles with no apparent loss of the antibody?s speciﬁcity and afﬁnity.
To construct an scFv library using phage display, genes of variable heavy (VH) and variable light (VL) chains of antibodies are prepared by reverse transcription of mRNA obtained from B-lymphocytes. The heavy and light chain gene products are ampliﬁed and assembled into a single gene using a DNA linker fragment. The assembled scFv DNA fragment is inserted into a phagemid vector and the recombinant phagemid is introduced into competent E. coli by CaCl2 transformation or electroporation. Ligation and bacterial transformation are crucial, as they directly inﬂu¬ence the size of the library. Phagemid-containing bacterial cells are grown and then infected with a helper phage (M13VCS or KO7) to yield recombinant phages that display scFv antibody fragments as fusion to one of the phage coat proteins. A detailed description of the steps involved in the construction of an immune scFv repertoire using phage display is shown in Figure 3. A summary of different vari¬ables considered for constructing an antibody library is presented in Table 2.
The size of antibody repertoires has been limited to �108 clones by the efﬁciency of DNA transfection into bacterial cells (as described above). Larger antibody repertoires of
�1010 clones have been prepared [23] using the process of combinatorial infection and in vivo recombination [24]. In this method, bacteria containing a repertoire of ?donor� heavy chains (encoded on a plasmid replicon) are infected with an ?acceptor? light chain repertoire (on phage). The two chains are then recombined on the same phage replicon within the bacterium. Using this process, antibody frag¬ments against a range of haptens and antigens, with afﬁni¬ties in the nanomolar range, have been obtained.
The quality of the library is important for its perfor¬mance. Library quality control can be achieved by checking the following parameters: (i) number of clones whose pha¬gemids contain the scFv insert, (ii) number of clones ex¬pressing phages carrying scFv, and (iii) number of clones expressing soluble scFv. These parameters can be assessed by a variety of methods including PCR screening of indi¬vidual clones (to detect the presence of the scFV insert), and

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445

dot blot analysis (to detect both phages displaying scFv and soluble scFv produced by the screened clones). Positive clones can be further characterized by DNA ﬁngerprinting, using a frequent cutter restriction enzyme, of PCR-ampli¬ﬁed scFv inserts and DNA sequencing.
2.2. Types of antibody repertoires
2.2.1. Naı¨ve repertoires: ?single pot libraries?
In this strategy, V-genes from the IgM mRNA of B-cells of unimmunized human donors are isolated from peripheral blood lymphocytes, bone marrow, spleen cells, or from animal sources. From small-sized human single-pot librar¬ies (3 � 107 antibody clones), antibodies have been isolated against ?foreign? antigens (e.g., bovine serum albumin and lysozyme), haptens (2-phenyloxazol-5-one), or ?self? anti¬gens (thyroglobulin, tumor necrosis factor �) [25]. The afﬁnity of these antibodies was similar to that seen in na¨ıve primary immune response and was sufﬁciently reactive in Western blot, ELISA, and FACS analysis [25].
A large sized na¨ıve library was constructed using lym¬phocytes from over 40 nonimmunized human donors and contained 1.4 � 1010 clones [26]. Antibodies were isolated from this library against all antigens tested with afﬁnities (Ka) in the low nanomolar range, typical for a secondary immune response [26]. Therefore, neither immunization nor afﬁnity maturation are required for generating human anti¬bodies with high afﬁnity.
Key advantages of single-pot repertoires include: (i) iso¬lation of human antibodies to self, nonimmunogenic or toxic antigens; (ii) a single library can be used for all antigens; (iii) short time needed for antibody generation (2?4 rounds of selection in two weeks); and (IV) direct isolation of high afﬁnity antibodies when very large reper¬toires are used. Disadvantages of na¨ıve libraries are: (i) low afﬁnity of antibodies isolated from small sized libraries; (ii) the time needed to construct large libraries, and (iii) content and quality of the library are inﬂuenced by the unequal
Fig. 3. Schematic diagram for constructing an immune scFv repertoire using phage display. Total RNA is ﬁrst isolated from spleen cells of B-lymphocytes and then mRNA is afﬁnity puriﬁed by afﬁnity chromatog¬raphy on oligo(dT)-cellulose. mRNA is reverse transcribed into cDNA using random hexamers. The heavy and light chain antibody genes are ampliﬁed in two separate reactions using two sets of primers designed to hybridize to opposite ends of the variable region of each chain. The puriﬁed heavy and light chain DNA products are assembled into a single gene using a DNA linker fragment constructed to hybridize to the 3�-end of the heavy chain and the 5�-end of the light chain. The assembled scFv DNA fragment is ampliﬁed by PCR using a set of primers designed to introduce restriction sites for cloning into a phagemid vector. Following restriction digestion and ligation of the scFv DNA to the phagemid, the ligated vector is introduced into competent E. coli by CaCl2 transformation or electropora¬tion. Phagemid-containing bacterial cells are grown and then infected with a helper phage (M13VCS or KO7), a process known as phage rescue, to yield recombinant phages which display scFv antibody fragments as fusion to one of the phage coat proteins.

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445 431

Table 2 Variables Considered in Making an Antibody Library
Variable Remarks

Source of variable domain genes and CDRs: High afﬁnity antibodies to immunogenic or disease-related antigen can be isolated from a) Immune or disease-related library immune or disease libraries b) Natural or synthetic libraries Natural or synthetic libraries are better source for antibodies to many antigens

Ampliﬁcation of antibody genes by: ? a) PCR b) Synthetic oligonucleotides c) Combination

Format of the displayed fragment: ScFv molecules have higher potential to form multimers a) scFv Size (scFv:25 kDa, Fab 50 kDa) b) Fab Stability issues (Fab is more stable)
Display system: ● Display in many copies using the major coat protein g8p (pVIII), or in few copies a) Phage or phagemid display using the g3p using the minor coat protein g3p (pIII) (pIII) or g8p (pVIII) ● For multivalent display using the g8p (pVIII), it will be more difﬁcult to select
higher afﬁnity clones
b) Cellular display systems: E. coli or yeast ● Phagemid systems using g3p (pIII) display are the most frequently used as they allow high frequency of monovalent display and easy conversion from phage-displayed antibody to soluble antibody
c) Ribosome display ● For cellular display systems, cell sorting may be used to enrich afﬁnity variants
● Ribosome display offers a cell-free molecular evolution system for antibodies

expression of the V-genes repertoire, unknown history of the B-cell donor, and potential limited diversity of the IgM repertoire.
2.2.2. Immune repertoire
In this library, V-genes are derived from the IgG mRNA of B-cells from an immunized animal or, in certain cases, human. Humanized immune repertoires can also be pre¬pared using immunized transgenic mice (xenomice). Xe¬nomice have been generated that harbor most of the human immune system V-genes in the germline (instead of the native murine immune repertoire) [27]. Immunization of these mice with a hapten or a foreign antigen results in the production of human-like antibodies in their B-cells. The antibody genes can be recovered from the B-cells by PCR and library selection or by fusion into a monoclonal cell line by hybridoma technology.
An immune antibody library has two main character¬istics: (i) it will be enriched in antigen-speciﬁc antibod¬ies, and (ii) some of these antibodies will have undergone afﬁnity maturation by the immune system [13,28]. Im¬mune libraries were used to produce antibodies against carcino-embryonic antigen (CEA) [29], T-cell recep¬tor-V� [30] and major histocompatibility complex/pep¬tide complexes [31]. High-afﬁnity antibodies were re¬portedly derived from mice [31], chickens [32], and rabbits [33]. Antibody libraries were also derived from sheep [34], cows and nonhuman primates [35].
Disadvantages of immune libraries include: (i) long time required for animal immunization, (ii) lack of im¬mune response to self or toxic antigens, (iii) the unpre¬dictability of the immune response to the antigen of interest, (iv) a new antibody library must be constructed for each antigen (this increases the total time of the procedure by 1?3 months), and (v) restrictions in gen¬erating human antibodies.
A unique application of immune libraries is to clone high-afﬁnity antibodies present after viral infections or can¬cer, and antibodies to self-antigens present in patients with autoimmune diseases. Analysis of such antibodies could aid in the identiﬁcation of antigenic epitopes involved in the humoral immune response. A second application of immune libraries involves the removal of irrelevant antibodies; this can be used to generate antibodies against minor or poorly immunogenic antigens. Animals can be made tolerant to certain antigens then immunized with a mixture of the relevant antigen and the irrelevant ones. This approach was used to isolate human antimelanoma antibodies from phage libraries of cancer patients immunized with autologous tu¬mor cells [36].
2.2.3. Synthetic repertoires
The speciﬁcity of any antibody resides in the six complementarity determining regions (CDRs) that shape the antigen binding sites (3 CDRs on each of the variable heavy and variable light chains). It became obvious from structural studies that ﬁve of the six CDRs have limited structural variation [37]. The CDR3 of the heavy chain (VH-CDR3) is the most diverse loop in composition and length (estimated potential diversity of 1023 sequences)
[38] and is most central to the antigen-binding site of all CDRs. Therefore, synthetic repertoires can be made by randomizing the VH-CDR3 region using oligonucleotide-directed mutagenesis or PCR-based techniques. Several synthetic repertoires were made using different strategies including the use of randomized light and heavy chain CDR3s [39] and diversifying all three CDR loops in one V-gene segment [40]. A major advantage of synthetic repertoires over na¨ıve ones is the potential to control and deﬁne the contents, local variability and overall diversity of synthetic libraries.

2.3. Selection of antibody libraries: ?bio-panning?
Antibody libraries are screened and enriched for antigen-speciﬁc clones by a technique known as bio-panning in which phages displaying scFv are incubated with an immo¬bilized antigen of interest [25,28]. Unbound phages are removed by washing whereas phages displaying scFv that speciﬁcally bind the antigen are eluted, by changing the binding conditions, and ampliﬁed in E. coli. This selection cycle is illustrated in Figure 4. Ideally, only one cycle of selection should be required, however the binding of non¬speciﬁc phage limits the enrichment that can be achieved per cycle. In practice, several rounds of selection are nec¬essary (average 2?4 cycles). Several bio-panning strate¬gies (Figure 5) are discussed below.
2.3.1. Selection using immobilized antigens
Phage libraries are selected by ﬂowing through an afﬁn¬ity column with the immobilized antigen of interest [28,41]. Following washing of the column to remove nonspeciﬁc clones, speciﬁc binders are eluted and ampliﬁed in E. coli. Selection can also be performed against antigen adsorbed onto plastic surfaces such as immunotubes (Maxisorb tubes; Nalge Nunc Intl., Naperville, IL) or enzyme-linked immu¬nosorbent assay (ELISA) plates [42,43]. Alternatively, an¬tigen may be immobilized on chips of BIAcore sensors [44].
It should be noted that selection of the immobilization method must take into consideration the conformational integrity of the immobilized antigen. Some phage antibod¬ies selected against an adsorbed antigen may not be able to recognize the native form of the antigen. One way to cir¬cumvent such problem is to employ indirect antigen coating through the use of antigen-speciﬁc capture antibodies [45].
Speciﬁc phage-displayed antibodies can be eluted from their speciﬁc antigens with acidic solutions (such as HCl or glycine buffer) [43,46], with basic solutions such as trieth¬ylamine [42], by enzymatic cleavage of a protease site constructed between the antibody and g3p [47], or by com¬petition with excess antigen [28].
2.3.2. Selection using antigens in solution
This technique allows solution binding and overcomes issues with conformational changes that are encountered upon coating antigens on solid surfaces. The use of labeled soluble antigens also allows a more accurate quantiﬁcation of the antigen used during selection [48] and consequently enhances the ability to use lower concentrations of the antigen to favor selection of high-afﬁnity phage antibodies. Following incubation of phage-antibodies with biotinylated antigen, phage bound to the labeled antigen are recovered with avidin or streptavidin-coated paramagnetic beads. Spe¬ciﬁc phages are then dissociated from the antigen and char¬acterized. One disadvantages of this technique is that anti¬streptavidin antibodies will also be isolated. However, this problem can be resolved by a depletion step using strepta¬vidin-coated beads.
2.3.3. Selection on cells
Direct selection of antibodies against markers on cell surfaces may be carried out on either monolayers of adher¬ent cells or on cells in suspension. Unbound phage can be washed away by rinsing tissue culture ﬂasks (monolayers) or centrifugation (cell suspension). To optimize the isola¬tion of antigen-speciﬁc binders and minimize the binding of irrelevant binders, a simultaneous positive and negative selection may be applied [49]. In this approach, a compe¬tition is set up between a small number of antigen-positive target cells and an excess of antigen-negative ?absorber? cells to bind antibodies of phage library; the absorber cells serve as a sink for the nonspeciﬁc adherence of irrelevant binders. A ﬂuorescently labeled antibody against an irrele¬vant antigen present only on the target cells is added and FACS is used to isolate the target cells binding the speciﬁc phage antibodies. Using a similar technique and a Fab library researchers isolated several anti-Rh(D) Fab antibod¬ies of clinical signiﬁcance [50]. Similar approaches can be utilized to identify putative tumor-speciﬁc antigens and pro¬vide a quick high-yield approach for isolating self-replica¬tive antibody fragments directed against novel or conforma¬tionally dependent cell surface markers. Another group subjected a scFv library to three rounds of positive selection on human melanoma cells and negative selection on human peripheral blood mononuclear cells [51]. Two scFv clones were isolated that recognize melanoma cells in ELISA and FACS [51]. Selections may also be carried out on tissue sections as well as whole tissues.
2.3.4. In vivo selection
In this method phage repertoires are directly injected into animals and then tissues are collected and examined for phage bound to tissue-speciﬁc endothelial cell markers as was demonstrated for peptide phage [52]. Pasqualini and Ruoslahti [52] were the ﬁrst to isolate phage-displayed peptides that home to selective vascular beds in vivo. In vivo panning has several advantages: (i) the isolated phage-dis¬played peptides home selectively to ?intact? targets of in¬terest; (ii) an inherent blocking step is included where most of the phage-displayed peptides that recognize ubiquitous plasma and cell surface proteins are eliminated; (iii) these peptides may be useful for the functional analysis of new receptors and potential identiﬁcation of novel drug target candidates because some of the isolated peptides have been found to bind to endothelial receptors expressed in the vasculature of speciﬁc tissues.
2.3.5. Remarks
Many laboratories have experienced practical difﬁculties with screening phage libraries. For example, panning of

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445 433

Fig. 4. Bio-panning of phage-display library. The library is screened in four steps: (1) binding of phages to the target antigen (in this case antigen immobilized on a solid support), (2) washing to remove unbound phage, (3) dissociation to recover antigen-speciﬁc phage, and (4) ampliﬁcation of the antigen-speciﬁc phage by infection of E. coli. Caution must be exercised during the binding and washing steps to avoid low-ionic strength or other conditions that may favor adsorption of phage directly onto plastic or other matrix.

Fig. 5. Different approaches for panning of phage libraries. Antigen col¬umns: phage libraries can be selected by ﬂowing the library through a column with immobilized antigen. Coated antigens: phage libraries can be selected on antigen adsorbed on plastic surface. Selection using biotinyl¬ated antigens in solution: this method is used to evade conformational change of antigen that occurs during coating. Bound and unbound phages are separated using avidin-coated magnetic beads. Selection on cells: is performed directly on monolayers of cells or on cells in suspension; unbound phages are removed by gentle rinsing or centrifugation. In vivo selection: in this method phage libraries are directly injected into animals and then tissues are collected and examined for phage bound to tissue-speciﬁc antigens.
antibody libraries suffers from failing to enrich for speciﬁc antibodies and recovery of only low-afﬁnity antibodies. Selective loss of high-afﬁnity phages during the selection cycles may be corrected by increasing the stringency of the phage elution from the target antigen. On the other hand, monitoring the antibody gene insert size in phagemids be¬tween two panning cycles indicated that the fraction of phages with full-size insert decreased during ampliﬁcation [53]. Phages with smaller insert (usually missing VH region) tend to overgrow phages with full-size inserts in mixed cultures. This may be abolished by picking a number of individual phagemid clones (with full-size inserts) after the last panning cycle and mix pure cultures for a ?polyclonal? antibody. Therefore, adjusting the elution and screening procedures during selection can determine whether high-afﬁnity phages are selected or discarded.
2.4. Production of soluble scFv molecules
To produce soluble scFv, antigen-positive phages are used to infect a speciﬁc strain of E. coli (e.g., E. coli HB2151) that will direct production of soluble scFv. Such
E. coli strain is termed ?nonsuppressor? cells as they rec¬ognize an amber stop codon, engineered between the scFv gene and g3 in the phagemid, and only express the scFv without the g3p protein. The phagemid is also designed to introduce polyhistidine tag fused to the expressed scFv, thereby permitting rapid and simple protein puriﬁcation by immobilized metal afﬁnity chromatography. Depending on the isolated clone, soluble antibodies may be present in the culture supernatant, the bacterial periplasm, and/or inside the bacterial cells. All three fractions must be isolated and analyzed in a Western blot, using a commercially available conjugated antihistidine (His) tag antibody, to determine the location of the soluble antibodies. Soluble scFv are rela¬tively simple to isolate, can be economically produced in bacteria in very large quantities [54,55], and do not entail complex refolding procedures [56].
3. Improving afﬁnity of phage antibody fragments
Although the antibodies selected from many immune or even large sized single-pot libraries may be extremely use¬ful for research purposes in ELISA, Western blots, or im¬munoﬂuorescence; their afﬁnity is often not sufﬁcient for use as sensitive diagnostic reagents.
Afﬁnity maturation may be circumvented by making multivalent molecules [57]; however, in vitro afﬁnity mat¬uration of selected antibodies may still be required in certain instances. V-gene chain shufﬂing [28] and site-directed mu¬tagenesis are used for afﬁnity maturation of scFv molecules. Other methods for randomization of protein sequences were also applied including propagation of the scFv genes in E. coli mutator strains [58], error-prone PCR [48], and DNA shufﬂing [59].
3.1. Multimer formation: enhancing the avidity of scFv fragments
The scFv molecule is about 30 kDa in size and consists ofaVH and VL domains tethered together via a polypeptide linker (usually 15 amino acid residues) that serves to im¬prove expression and folding efﬁciency. A scFv molecule is

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445 435

monovalent with a single functional paratope; consequently it has low avidity. Using a short linker of 5 amino acid residues between the VH and VL domains of the scFv was found to prevent the alignment of V-domains into a single scFv and lead to the association of two scFv molecules forming a dimer termed a ?diabody? [60,61]. A diabody, with a molecular size of about 60 kDa, is an scFv dimer with two functional paratopes and higher avidity than scFv frag¬ments. Reducing the length of the linker to three residues prevented the formation of scFv dimers and instead directed the association of three scFv molecules to form a trimer (a 90-kDa triabody with three paratopes) [61] and/or a tetrava¬lent tetrabody [62]. Bispeciﬁcity can be also achieved by fusing two different scFv [63,64]. Clearly, this approach permits the design of multi-speciﬁc binding molecules with chosen size and functional afﬁnity.
3.2. Afﬁnity maturation by site-directed mutagenesis
In this method, the amino acids of one or more of the CDRs are substituted with different residues followed by the selection of clones with higher afﬁnity for the target antigen. A reﬁnement of this method ?parsimonious mu¬tagenesis? was developed [65]. In this strategy, the entire CDR sequence of an antibody fragment is screened to iden¬tify amino acids that are actively involved in the antigen binding. First, the number of codons introduced is limited such that each amino acid is only coded for by a single codon. The amino acids at each position are then manipu¬lated to favor parental sequences, conservative changes, and those that appear more frequently in CDR regions of the antibody. Because parsimonious mutagenesis provides in¬formation about the contribution of distinct amino acids to binding and afﬁnity, this process can be used as an initial step in the afﬁnity maturation of recombinant antibodies.
3.3. Afﬁnity maturation by chain shufﬂing
Chain shufﬂing provides alterations to the intrinsic af¬ﬁnity of a speciﬁc monovalent scFv. In this process, the scFv molecule is subjected to a series of manipulations in which the gene for one chain (e.g., VH) of the scFv molecule is cloned into a repertoire for the second chain (VL) [66]. The resulting scFv library will contain the scFv-phage with VH chains speciﬁc for the target antigen and random VL chains. The library is panned against the antigen to identify clones with improved binding properties. The new VL gene is then cloned into a repertoire of VH genes. To maintain the speciﬁcity of the parent scFv molecule, the VH CDR3 (that contains most of the contact residues to the antigen) is retained without changes. Therefore, only the VH segment from frameworks 1 to 3, including the CDRs 1 and 2, are replaced. Using this strategy, the afﬁnity of a nonimmune human scFv which binds the glycoprotein tumor antigen c-erbB-2 (Kd � 1.6 � 10�8 M), was increased sixfold (Kd � 2.5 � 10�9 M) by light-chain shufﬂing and ﬁvefold (Kd
Table 3 Example Peptide Ligands Selected from Phage Display Libraries
Target Protein Peptide Sequence Reference
Atrial natriuretic peptide *MCHFGGRMDRISCYR 155
receptor-A
Concanavalin A MYWYPY 75
GPIIb/IIIa ?CNWKRGDC 156
Steptavidin AECHPQGPPCIEGRK 157
Thrombin receptor MSRPACPNDKYE 79
TPO (human thrombopoietin IEGPTLRQWLAARA 158
receptor)

A disulﬁde bond between underlined cysteine residues leads to the formation of a cyclic peptide
? Both the C-and N-termini of this peptide are modiﬁed as �CONH2 and �OCCH3, respectively.
� 3.1 � 10�9 M) by heavy-chain shufﬂing, values compa¬rable to those for antibodies against the same antigen pro¬duced by hybridomas [67].

In vitro diagnostic applications of phage display
4.1. General applications
4.1.1. Phage-peptide applications
4.1.1.1. Phage display of random peptides. Synthetic oligo¬nucleotides with a constant length but with unspeciﬁed codons, randomized through site-directed mutagenesis us¬ing degenerate oligodeoxynucleotides, are cloned as fusions to one of the coat proteins of M13 phage where they are expressed as peptide-capsid fusion proteins. Phage-borne peptides exhibit a wide mimicking potential to linear, con¬formational and nonproteinaceous epitopes [68,69]. These random peptide libraries can be tested for binding to target molecules of interest (Table 3). The display of random peptides on ﬁlamentous bacteriophage as fusion to either g3p or g8p coat proteins [1,70 ?72] has allowed the identi¬ﬁcation of peptides that speciﬁcally bind to a variety of targets including antibodies [73], streptavidin [74], ribonu¬clease S [69], and concanavalin A [75].
Peptides selected against a particular target that had similar sequences played a role in identifying a sequence motif necessary for binding [76]. In cases where the selected peptides did not resemble the natural peptide ligand, they were termed mimotopes [77,78]. Peptide sequences identi¬ﬁed by phage display have been shown to act as agonists and antagonists of receptors [79]. Peptides that neutralize immunoglobulins may be employed as diagnostic reagents (see Section 4.3.) or used as therapeutic agents for control¬ling autoimmune diseases [80]. Random peptide libraries can be used for mapping epitopes of monoclonal and poly-clonal antibodies, identifying peptide ligands, and develop¬ing ?substrate phage? to deﬁne substrate sites for different enzymes [81,82]. Finally, display of small peptides on the surface of phage particles can increase their immunogenic¬ity and consequently their potential as vaccine candidates.

4.1.1.2. Mapping antibody epitopes. Fragments of DNA that encode parts of the protein antigen are fused to a gene encoding one of the capsid proteins. Phage particles dis¬playing antigenic peptides can be used for mapping epitopes of monoclonal and polyclonal antibodies [83]. Phage dis¬play libraries of random peptides have also proven useful for identifying antibody epitopes in cases in which the antigen is not available or even not yet known [84].
4.1.1.3. Generating immunogens. Small segments of differ¬ent proteins displayed on M13 virus particles were used to elicit antibodies against the coat proteins of parasites and viruses. The immunologic response to injected M13 phage is T-cell dependent and does not require adjuvant.
4.1.2. Phage-antibody applications
4.1.2.1. Isolation of high-afﬁnity antibodies Phage-dis¬played recombinant antibodies have several advantages over monoclonal antibodies generated by hybridoma tech¬nology. In comparison to the time-consuming and labor-intensive cell screening processes of hybridoma production, antibody genes can be cloned directly from spleen cells using rapid recombinant DNA methods. Generation of a large natural display library from variable gene repertoires can eliminate animal immunization and large-scale cell cul¬ture for hybridoma development and allow isolation of antibodies with high afﬁnity against any antigen. Phage display is particularly useful in cases where monoclonal antibodies could not be obtained by classical hybridoma technique such as antibodies against nonimmunogenic or toxic antigens. Phage displayed antibodies have stable genetic source. Phage antibody technology can also be used to clone and rescue monoclonal antibodies from genetically unstable hybridomas. Phage antibody genes can be easily sequenced, mutated, and screened to im¬prove antigen binding. Finally, soluble recombinant an¬tibodies (not displayed on phage) can be produced quickly and economically and can be used as in vitro diagnostic reagents.
4.1.2.2. Catalytic antibodies Catalytic antibodies are gener¬ated by immunization with haptens that are analogs of rate-determining transition state structures in a particular chemical reaction. The energy associated with the formation of the antibody-transition state complex decreases the acti¬vation energy for the chemical reaction and increases the reaction rate.
The ability of the native immune system has already been exploited to obtain catalytic antibodies [85]. Antibody phage libraries should also prove a useful source of catalytic antibodies. A potentail added advantage for searching anti¬body libraries for catalytic antibodies is the ability to select for actual catalysis rather than for binding activity only [86].
4.1.3. Directed evolution of proteins
The coding region of a protein, that possesses useful physicochemical or other properties, can be altered by cas¬sette mutagenesis, error-prone PCR or shufﬂing to generate a group of modiﬁed sequences. A library of recombinant phages displaying a multitude of variants of the parental protein is constructed and afﬁnity selected to isolate fusion phages that display variants with the highest binding char¬acteristics for a target. Because each phage particle links a particular gene (located inside the particle) to the gene-encoded protein displayed on the phage surface, the primary structures of the desired protein variants can be elucidated by DNA sequencing. This approach was used to identify novel enzyme inhibitors and antagonists [87]. Most recently a novel database has been established that incorporates data on full-length proteins, protein domains and peptides that were obtained through in vitro directed evolution processes mainly by phage display [88].
4.1.4. Phage enzymes
Several enzymes have been displayed on M13 bacterio¬phages and retained their catalytic activities. These include alkaline phosphatase [89], trypsin [90], and �-lactamase [91]. In theory, any enzyme that can be expressed in E. coli may also be displayed on M13 phage.
Phage display libraries based on suitable enzymes can improve diagnostics by enhancing the stability and catalytic activities of enzymes, and probably enabling the engineer¬ing of catalysis that is modiﬁable by antigen binding.
4.2. Production of diagnostic reagents for single-step detection of target antigens: genetic fusions of antibody fragments to reporter molecules
The antibody-fusion proteins provide high sensitivity in diagnostic assays because they enable signal ampliﬁcation after the initial binding of the antibody to its target antigen. Antibody fragments have been fused to alkaline phospha¬tase, green ﬂuorescent proteins, and lipids [92] for diagnos¬tic applications. In practice, recombinant designs for anti¬body fusions are only limited by an expression system capable of producing correctly folded protein products.
4.2.1. ScFv-alkaline phosphatase fusion protein
Harper et al. subcloned the DNA encoding the antiluteo¬virus scFv, obtained from a synthetic phage antibody library after four rounds of panning, into the expression vector pDAP2 [93]. Following transformation of the recombinant plasmid into bacteria and induction with IPTG (isopropyl¬
�-D-thiogalactopyranoside, an inducer of the lac operon), a bifunctional fusion protein consisting of scFv fused to the N-terminus of alkaline phosphatase was produced. An oli¬gonucleotide sequence encoding hexa-histidine was added to the 3� end of the alkaline phosphatase gene to allow puriﬁcation of the fusion protein by immobilized metal afﬁnity chromatography. Because alkaline phosphatase is a

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425?445 437

dimer, an additional advantage of its fusion to scFv is the simultaneous production of a bivalent antiluteovirus scFv that should have a greater avidity than monomer scFv [94]. The scFv-alkaline phosphatase fusion protein was used di¬rectly in ELISA to detect luteovirus in sap extracts from infected plants. These results demonstrate the feasibility of fusing scFv to alkaline phosphatase for direct single-step detection of target antigens.
4.2.2. Fluobodies
Antibodies conjugated to the ﬂuorochrome ﬂuorescein isothiocyanate (FITC) have been used extensively in immu¬noﬂuorescence and phenotyping by ﬂow cytometry tech¬niques for the diagnosis of various diseases [95]. However, FITC is sensitive to photo-bleaching by illumination. Green ﬂuorescent proteins (GFP) were reported to have compara¬tive ﬂuorochrome characteristics to FITC, however they have increased stability. Griep et al. [96] developed an expression system (pSKGFP) which permits the expression of scFv as fusions with GFP ?ﬂuobodies?. A His-tag was added to the C-terminus of the GFP to allow puriﬁcation of ﬂuobodies by immobilized metal afﬁnity chromatography. Fluobodies against lipopolysaccharides of the bacterium Ralstonia solanacearum were produced in bacterial cultures and shown to function well in ﬂow cytometry and immu¬noﬂuorescence cell staining. Fluobodies retain their speci¬ﬁcity for their target antigens and, unlike FITC-conjugated antibodies, they do not fade upon illumination. Further¬more, the investigation of ﬂuobodies with other spectral properties might allow simultaneous multiple labeling of different epitopes.
4.3. A three-step strategy for characterization of human sera by phage-displayed random peptide libraries
The onset of a disease is frequently associated with the appearance in patient?s serum of speciﬁc antibodies that target all of the infectious agent determinants that are im¬munologically relevant to the host. The detection and char¬acterization of such antibodies could lead to the discovery of disease-speciﬁc epitopes and may have great diagnostic and prognostic signiﬁcance. Also, the identiﬁcation and staging of several infectious diseases depend mainly on the characterization of a speciﬁc immune response in the pa¬tient. Such analysis requires identiﬁcation of the natural antigen against which the immune response is directed. This may be hampered if the antigen is unavailable or is simply unknown.
Extensive evidence has accumulated to substantiate the conclusion that phage displayed libraries of random pep¬tides have speciﬁc ligands for almost any given antibody [97]. A three-step strategy was developed [98] to identify disease-speciﬁc phage-borne peptides that entails: (a) afﬁn¬ity selection of peptide libraries, (b) screening of selected phage by sera from other patients, and (c) counter-screening with negative sera. The entire procedure can be accom¬plished in absence of information about the etiologic agent or its antigens.
4.3.1. Afﬁnity selection of phage-displayed peptide libraries
A phage peptide library is afﬁnity-selected with one disease-speciﬁc serum. Afﬁnity selection can be accom¬plished by direct coating of partially puriﬁed immunoglobu¬lins onto the surface of polystyrene beads, or tethering immunoglobulins on the surface of magnetic beads via the use of antihuman Fc secondary antibodies covalently linked to the beads. The later method has two advantages: (i) proper orientation of the serum immunoglobulins that al¬lows the maximum number of available antigen-binding sites to interact with the target peptides, and (ii) it avoids the partial denaturation of serum antibodies that may result from their direct coating on the beads.
4.3.2. Filter immuno-screening of afﬁnity-selected phage
In conventional selection of peptide libraries using puri¬ﬁed antigens, several rounds of selection are often needed to eliminate nonspeciﬁc clones. However, in the growth cycle that follows each round of selection, different phages can be ampliﬁed at different rates thus introducing a biologic se¬lection that does not relate to that obtained by afﬁnity. Furthermore, because polyclonal antibodies have a wide spectrum of afﬁnities and concentrations; several rounds of selection may lead to the ampliﬁcation of peptide-phages that are recognized by only particular antibody subsets. Because no information is available on the afﬁnity and/or the concentration of disease-speciﬁc antibodies, it becomes very difﬁcult to predict whether multiple selection rounds would effectively favor enrichment of disease-speciﬁc pep¬tide phage. Such problems can be avoided by reducing the number of selection cycles and the identiﬁcation of positive phage by direct immunoscreening of a large number of selected clones transferred to nitrocellulose membranes. More than one patient serum can be used for the immuno¬screening step to identify most of phage displaying epitopes recognized by disease-speciﬁc antibodies.
4.3.3. Counter-screening with negative sera
Positive clones are ﬁnally screened using different sera from normal individuals. Phage clones that are not recog¬nized by most of the sera not related to the speciﬁc disease but react with antibodies in patient?s sera can then be iden¬tiﬁed and characterized.
Using the above strategy, Minenkova et al. [99] screened several phage libraries displaying random peptides fused to the N-terminus of the major coat protein g8p against nega¬tive and positive sera for HCV [99]. Several peptides that bind HCV-speciﬁc antibodies were identiﬁed [99]. Syn¬thetic peptides with similar sequences to those displayed on the phage lost their ability to detect HCV antibodies. To overcome this difﬁculty, the selected peptides were ex¬pressed as octabranching multiple antigen peptides that sim¬ulated display of multiple copies of the peptide on the phage surface [100 ?102]. The multimeric synthetic peptides re¬tained their speciﬁcity and were used to develop a diagnos¬tic assay to detect HCV antibodies in serum [99].

Similarly, Kouzmitcheva et al. [103] used antibodies from a panel of human sera from patients with Lyme disease to afﬁnity select peptide epitopes from 12 large random phage-peptide libraries. They identiﬁed 17 peptides with a diagnostically useful binding pattern: reactivity with at least three positive sera and no reactivity with any of the negative sera. Again, the method used to discover these peptides did not require any knowledge of the pathogen and involved generic procedures that are applicable to any emerging infectious disease for which no pathogen has yet been iden¬tiﬁed.
5. Selected therapeutic applications of phage display
Phage display has allowed the isolation of numerous proteins and peptides of therapeutic signiﬁcance. Phage display provides access to a vast untapped pool of human monoclonal antibodies with antitumor and antiviral activi¬ties. When combined with toxins or radio-isotopes, scFv antibodies can be advantageous for cancer immunotherapy because their small size allows greater tumor penetration and faster clearance rates [67]. Fabs isolated against viral pathogens provide research tools, diagnostics and potential pharmaceutical reagents for the prophylaxis and treatment of viral infections [104,105]. On the other hand, random phage peptides selected against antibodies from HIV-in¬fected individuals uncovered immunogenic epitopes that behave as antigenic mimics of gp120 and gp41 HIV pro¬teins and, therefore, have the potential for use as broadly protective HIV-1 vaccine candidates [106]. Peptides se¬lected by phage display have also been used to bind inte¬grins, cell surface receptors necessary for anchorage and regulation of cell differentiation and migration, to prevent tumor invasion [107] and platelet aggregation [108].
5.1. Recombinant ScFv antibodies with antitumor activities
Human antibodies can be obtained by combining immu¬nization of transgenic mice containing human immunoglob¬ulin genes and classic hybridoma technology [109,110]. However, selection of human recombinant antibodies from antibody libraries displayed on phage eliminates the time required for immunization and permits methods aimed at optimizing the afﬁnity of the selected antibodies. Huls et al.
[111] isolated an scFv antibody fragment that recognizes a tumor-associated antigen Ep-CAM from a semisynthetic (nonimmune) phage antibody library. Selection was per¬formed by subtractive selection of scFv antibody fragments on intact, labeled colorectal tumor cells in the presence of an excess of absorber cell line. Flow cytometry was then used to isolate labeled cells and cell-bound phages were eluted and propagated. To increase the half-life of scFv fragment in circulation, the isolated scFv fragment was converted into an intact human IgG1 by insertion into mammalian expres¬sion vectors containing the genes encoding human immu¬noglobulin constant regions [4]. The puriﬁed IgG1 had a low nM afﬁnity and mediated tumor cell death [111].
5.2. Inhibition of prion propagation using Fab antibodies
Prions are the infectious agents believed to cause neuro¬degenerative diseases such as scrapie and bovine spongi¬form encephalopathy. Direct interaction between the infec¬tious and the endogenous forms of prion protein is suggested to drive the formation of the infectious isoform [112]. Therefore an antibody that can bind either form of the protein is suggested to inhibit the generation of the infec¬tious prion conformer [113]. A Fab antibody that recognizes adeﬁned region on the cellular form of prion was selected from phage display libraries prepared from prion-deﬁcient mice immunized with infectious prions [114]. Treating prion-infected neuroblastoma cell cultures with the isolated antiprion Fab abolished conversion of endogenous prion to the infectious protein [113]. These Fab fragments could be converted into whole IgG molecules and may play a role in treating prion diseases [113].
6. Recent innovations in display technology
6.1. Selectively infective phage (SIP)
In phage display, all phage particles remain infective as long as they have the wild type g3p (pIII) expressed at the tip of the phage. Therefore, the DNA of both speciﬁcally and nonspeciﬁcally bound phages enter bacterial cells by infection after elution from the ligand. Major tasks for phage display are to minimize adsorption of nonspeciﬁc phage to the ligand [115] and to enrich phage displaying high-afﬁnity molecules over abundant low afﬁnity binders [48]. In SIP technology [116], the N-terminal domains of g3p are replaced with the gene for a peptide or a protein leading to the generation of noninfective phage particles [117,118]. The missing N-terminal domains necessary for infection are supplied within adapter molecules consisting of the ligand (protein, peptide, or a small organic molecule) covalently coupled to these N-terminal domains. When the noninfective phage and the adapter molecules are mixed, infectivity is restored only to phage particles displaying protein or peptide that are capable of binding the ligand with the latter providing the missing N-terminal domains of g3p to the phage. SIP technology is a low background procedure that eliminates the need for the inefﬁcient physical separa¬tion of speciﬁc binders from the nonspeciﬁc ones and is therefore suggested as an efﬁcient and rapid procedure to select for high afﬁnity interactions [116].

H.M.E. Azzazy, W.E. Highsmith Jr. / Clinical Biochemistry 35 (2002) 425? 445 439
Table 4
List of BsAbs with Potential Diagnostic Signiﬁcance
Method used for generating the BsAb First Antigen (Reporter Enzyme) Second Antigen (Target) Reference
Hybridoma-hybridoma fusion Cross-linking of two Mabs to form bispeciﬁc tetrameric antibody complex Fusing hybridoma to splenocytes Hybridoma-hybridoma fusion Hybridoma-hybridoma fusion Bispeciﬁc F(ab�)2 generated by disulﬁde bond exchange between IgG1 Mabs ScFv diabody ScFv diabody ScFv diabody Urease Alkaline phosphatase Horseradish peroxidase (HRP) HRP �-galactosidase Alkaline phosphatase �-galactosidase �-galactosidase �-galactosidase HCG Native human erythropoietin Human lymphotoxin Biotin Follitropin Human TSH Hen-egg lysozyme Carcinoembryonic antige

emmebar

Uno sbozzo al traduttore automatico, ma che ch'azzecca sta roba ?

ah già siamo in OT, magari con calma, ce la spieghi, da un'altra parte però perchè questa la chiudo.

La biochimica clinica 35 (2002) 425-445
Visualizzazione
Phage espone la tecnologia: domande cliniche e le innovazioni recenti
Hassan M. E. Azzazya, |b|,*, W. Edward Highsmith, Jra
ADepartment di patologia, la scuola di University of Maryland di medicina, Baltimore, USA
BDepartment di medico ed indagano tecnologia, la scuola di University of Maryland di medicina, Baltimore, USA

Astragga

La mostra di Phage è una tecnologia di diversità molecolare che permette la presentazione di peptide grande e biblioteche di proteina nel superficie del |phage| filamentoso. Phage espone le biblioteche permettono la selezione di peptide e proteine, anticorpi di inclusione, con alta affinità e specificità per quasi alcune obiettivo. un vantaggio cruciale di questa tecnologia è il collegamento diretto che esista tra il fenotipo sperimentale ed i suoi incapsulò il genotipo, che permette l'evoluzione delle persona che lega selezionate nelle molecole ottimizzate. La mostra di Phage facilita l'ingegneria di anticorpi a proposito della loro taglia, valenza, affinità, e funzioni di effettore. La selezione di anticorpi e peptide da biblioteche esposte nel superficie del |phage| filamentoso ha significativo provato per l'isolamento di routine di peptide ed anticorpi per domande diagnostiche e terapeutiche. Questa visualizzazione serve come un'introduzione a mostra di |phage| , ingegneria di anticorpo, lo sviluppo di di |phage| esposto peptide e frammenti di anticorpo in reagenti diagnostici vitali, ed i trend recenti nella tecnologia di mostra. 2002 La società canadese dei chimici clinici. Tutti i diritti riservati.
Parole chiavi: Mostra di Phage; I frammenti variabili della catena singola; Peptide di Phage; Diagnostica di Immuno; Gli anticorpi ricombinanti; Panoramica; Anticorpi di Bispecific

Indici

Veduta d'insieme e prospettive

1.1. Introduzione
1.2. Filamentoso Phage
1.2.1. Struttura

1.2.2. Ciclo vitale
1.2.3. Vettori di Phagemid Cloning
1.3. La molecola di anticorpo: un sinossi
1.3.1. Struttura
1.3.2. I meccanismi responsabile per la diversità di luoghi di rilegatura di antigene
1.3.3. Frammenti di anticorpo
2 Costruzione e schermatura di biblioteche di anticorpo di Phage esposto:

2.1. La costruzione delle biblioteche di scFv Phage Display
2.2. I tipi di repertori di anticorpo
2.2.1. Na?¨repertori di |ve|: "La singola spara le biblioteche"
2.2.2. I repertori immuni

L'autore corrispondente. University of Maryland School della medicina, 10 S. Pine Street, Rm 7-56, Baltimore, MD 21201. Tel.: ?410-706-7011; facsimile: ?410-706-8414.
E-indirizzo di posta: [email][email protected][/email] (H.M.E. Azzazy).
2.2.3. I repertori sintetici
2.3. La selezione di biblioteche di anticorpo: "Panoramica di biografia"
2.3.1. La selezione usando gli antigeni immobilizzati
2.3.2. La selezione che usa antigeni nella soluzione
2.3.3. La selezione in celli
2.3.4. La selezione in vivo
2.3.5. Commenti
2.4. La produzione delle molecole di scFv solubili

Migliorare l'affinità dell'anticorpo di |phage| si frammenta
3.1. Multimer Formation: Migliorare l'avidità di scFv si frammenta
3.2. La maturazione di affinità per il mutagenesi di Site diretto
3.3. La maturazione di affinità per Chain Shuffling
2 Le domande diagnostiche in vitro di Phage Display

4.1. Le domande generali
4.1.1. Domande di peptide di Phage:
4.1.1.1. La mostra di Phage delle peptide casuali
4.1.1.2. |epitopes| di anticorpo di rilevamento
4.1.1.3. Gli immunogeni generanti
4.1.2. Domande di anticorpo di Phage:
4.1.2.1. L'isolamento di anticorpi di alta affinità

0009-9120/02/$- veda la questione anteriore 2002 La società canadese dei chimici clinici. Tutti i diritti riservati. PII: S0009-9120 (02) 00343-0
H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445

4.1.2.2. Gli anticorpi catalitici
4.1.3. Diriga l'evoluzione di proteini
4.1.4. Enzimi di Phage
4.2. La produzione dei reagenti diagnostici per scoperta di passo singolo di antigeni di obiettivo: Genetico Fu¬il |sion| dell'anticorpo si frammenta a Reporter Mole¬|cules|
4.2.1. pro di fusione di fosfatasi di ScFv alcalino¬|tein|
4.2.2. Fluobodies
4.3. una strategia di tre passi per la caratterizzazione di umano Sera per la peptide di Phage esposto Librar¬[...]
4.3.1. La selezione di affinità delle biblioteche di peptide casuali di Phage esposto
4.3.2. Filtri la schermatura di Immuno dell'affinità Se¬il |lected| Phage
4.3.3. La schermatura contraria con Negative Sera
5. Selezioni le domande terapeutiche di Phage Display
5.1. Gli anticorpi di scFv ricombinanti con attività contro-tumori
5.2. L'inibizione di Prion Propagation che usa gli anticorpi favolosi
6. Le innovazioni recenti nella tecnologia di mostra
6.1. Selettivamente infettivo Phage (sorso)
6.2. Pianificare gli anticorpi di Bispecific
6.3. Biblioteche di Phage di panorama
6.4. Mostra di ribosoma
2 Conclusioni
Referenzi

Veduta d'insieme e prospettive
1.1. Introduzione
Phage espone, il primo presentato per G. Smith in 1985 1, è un modo molto effettivo per produrre numeri grandi ( fino a 1010 ) di peptide diverse e proteini ed isolando la talpa¬i |cules| che compiono le funzioni specifiche ( per le visualizzazioni veda 2-10). Questa tecnica si può usarsi anche a studiare le interazioni di legante di proteina 11 , recettore e rilegatura di anticorpo situano 3,4, ed a migliorare o cambiare l'affinità di proteini per i loro partner impegnativi 5,7. La mostra di Phage coinvolge i |expres|¬il |sion| di proteine, includendo gli anticorpi, o le peptide nel superficie del |phage| filamentoso. sequenze di DNA dell'interesse si inseriscono in un'ubicazione nella genoma di |bac| filamentoso¬|teriophage| tale che la proteina codificata si esprime o " espose " nel superficie del |phage| filamentoso come un prodotto di fusione ad uno del |phage| rivestono le proteine (Figure 1). Là¬la parte anteriore, invece di dovere pianificare geneticamente proteini o varianti di peptide un-per-un ed allora esprima, purifichi si, ed analizzi ogni il |phage|, vario espone le biblioteche contenendo

Fico 1. Il diagramma schematico di un |phage| filamentoso che espone la singola incatena il frammento variabile (scFv) le molecole. Il |phage| consista di circolare SsDNA circondato per una proteina di giacca. g8p (pVIII) è la proteina di giacca maggiore mentre G3p, alla punta del |phage|, sono uno delle proteine di giacca minori. I geni che codificano i domini variabili dello ScFv ed un collegamento si mune di miccia a gene III (g3) nella genoma del |phage| filamentoso. Di conseguenza, lo scFv si espone come una fusione a g3p (pIII) la proteina alla punta del |phage|. In realtà, lo scFv non si mune di miccia a tutte le molecole di proteina di g3p, e perciò il |phage| trattiene la sua abilità ad infettare il |bacteria|. Quattro molecole di g3p si illustrano nella figura, tre di che espongono le molecole di scFv.
diverso bilione varianti si può costruire simultaneamente. Queste biblioteche poi possono essere facilmente usato a selezionare e purificare sequenze che porta specifiche di particelle di |phage| con le specificità di rilegatura desiderati dai varianti nonbinding.
Due scoperte importanti erano essenziale per lo sviluppo di |phage| di anticorpo esponga la tecnologia. Primo, il |demonstra|¬

H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 427

il |tion| che il DNA straniero inserí nel gene di |phage| filamentoso III (g3) si esprime come una proteina di fusione ed espose nel superficie del |phage| 1. Assecondare, l'espressione riuscita dell'anticorpo funzionale si frammenta nello spazio di |periplasmic| di
E. il |coli| 12,13.
un aspetto significativo della mostra di |phage| partora collegando il fenotipo di alcune peptide o proteina di batteriofago esposto con il genotipo codificando quella molecola, pacco dentro la stessa virione. Questa permette la selezione ed amplificazione dei cloni specifici del |phage| rappresentando desiderò legando le sequenze dalle piscine di bilioni di cloni di |phage|. In caso di |phage| filamentoso, l'amplificazione è semplicemente compiuta infettando il |coli| di E. maschio. Il collegamento di fenotipo di genotipo anche permette la determinazione rapida della sequenza di amminoacido della molecola di peptide o proteina impegnativa specifica per l'ordinamento di DNA dell'inserto specifico nella genoma di |phage|.
I tentativi si facevano a trovare i metodi di mostra alternativi tale come la mostra sui superficie batterici 14, il fermento fanno affiorare 15, o direttamente nel DNA di plasmidio di codificare ( le peptide¬la biblioteca su plasmidi; 16). Comunque, come tutti questi sistemi comportano ancora la trasformazione di un oste cellulare, loro non hanno il |suc|¬il |ceeded| stare generare le biblioteche di diversità grandi.
Questa visualizzazione, sebbene non comprensivo a proposito degli ammontari impressionanti di |phage| esponga il lavoro diede una rappresentazione sulla decade passata, focalizzano per principio del |phage| esponga tecnologia, i metodi per la costruzione e panoramica di biografia di biblioteche, tipi di anticorpo di |phage| di repertori di anticorpo, e gli approcci diversi a migliorare l'affinità di |recom|¬anticorpi di |binant|. Accentua anche le domande diagnostiche in vitro dei peptide ed anticorpi di |phage| esposto, selezionò le domande terapeutiche di anticorpi ricombinanti e trend recenti nel |phage| espongono la tecnologia.
1.2. Il |phage| filamentoso
1.2.1. Struttura
I batteriofagi, o semplicemente |phages|, sono i virus che infettano una varietà del |bacteria| gram-negativo che usano il |pili| come i recettori. Le particelle di |phage| filamentose di Ff ( tendono M13, f1 e |fd| ), quello infetti il |coli| di E. via |pili| di F, consista di un arenato singolo (|ss|) il DNA che è racchiuso in una giacca di proteina. La genoma intera del |phage| consiste di 11 geni. un |phage| vitale esprime su 2700 copie di 8 proteina di gene ( g8p o pVIII, un 50 proteina di residuo di |aa| che è anche conosciuto con il nome della proteina di capside maggiore ) e da 3 a 5 copie del gene III (g3) la proteina di adsorbimento di -encoded ( g3p o pIII, un 406 proteina di |aa| che è uno di tre proteine di giacca minori del |phage| filamentoso )in la sua punta( figura 1 ) ( per la visualizzazione veda 17 ).
1.2.2. Ciclo vitale
Il |phage| filamentoso non produce un'infezione di in
E. |coli|, ma piuttosto inciti uno stato in che il |bacteria| infetto produce e cela le particelle di |phage| senza sotto¬il lisi bene avviato. L'infezione si inizia per l'attaccamento del |phage| G3p ai |pilus| di |f| di un |coli| di E. maschio ( e.g., E. il |coli| TG1 ). Solo il |phage| circolare ssDNA entra il batterio dove esso si converte per l'apparato di risposta di DNA di oste nel plasmidio arenato duplice piace del |replicative| forma (RF). Il RF subisce la risposta di cerchio rotolante a fare ssDNA ed anche servono come una maschera per l'espressione del pro di |phage|¬i |teins| g3p e g8p. Il progenie di Phage si assembla per il pacco¬fare invecchiare di ssDNA nella proteina riveste ed estruse attraverso la membrana batterica nel mezzo.
Il |phage| riveste le proteine g3p e g8p sono complicati nella clonazione e scoperta degli anticorpi e peptide del |phage| ricombinanti. Gli anticorpi ricombinanti, e piegò proteini, è espresso tipicamente come proteine di fusione di g3p ed esponga si alla punta del |phage| di M13. Quando questi anticorpi si incastrano all'antigene il |phage| di confine si scopre con un HRP-identificò l'anticorpo ( Amersham Pharmacia Biotech; Uppsala, la Svezia ) quello riconosca la proteina di giacca di g8p. Da diverso mille copie di g8p esista nel superficie di |phage| , lo |effec|¬la |tively| amplifica il segnale di scoperta. D'altra parte, le peptide si possono esporre come le fusioni ad o g3p o g8p. Se le peptide si munissero di miccia a G8p, limiti il |phage| si può scoprire usando gli anticorpi monoclonali del ratto che riconoscono un |epitope| localizzò nella porzione di N finale di g3p 18.
1.2.3. Phagemid clonando i vettori
Con il |phage| di M13 , ci ha due formi del DNA di |phage|: le maschere di ssDNA che possono essere facilmente preparato da media di |phage| ed usò per ordinare in sequenza; e DsDNA ( i |plas|¬medio-come il RF ) quello potere isolare dall'oste batterico infetto ed usò per clonare di un frammento di obiettivo. Phagemids, un vettore più popolare per mostra, sono gli ibridi di vettori di |phage| e plasmidio. Phagemids si progettano per contenere le origini di risposti per entrambi il |phage| di M13 e |coli| di E. in più di gene III, appropriano i luoghi di clonazione multipli, ed un gene di resistenza antibiotica 19. Comunque, mancano tutto altri prodotti di gene strutturali e nonstructural richiesti per generare un |phage| completo. Phagemids si possono crescere tanto plasmidi o alternativamente pacco come il |phage| di M13 ricombinante con l'aiuto di un |phage| di aiutante che contiene un'origine leggermente difettosa della risposta (tale come M13KO7 o VCSM13) ed approvvigionamenti, in |trans|, tutte le proteine strutturali richieste per generare un |phage| completo. Questo processo si chiama la "liberazione di |phage|". Le particelle di |phage| di risultare possono incorporarsi PIII dedotto dal |phage| di aiutante o la proteina di fusione di pIII di polipeptide, codificato per il |phagemid|. I rapporti della proteina di fusione di pIII di polipeptide: il tipo selvatico PIII potere variare tra 1:9 e 1:1000 dipendendo nel tipo di |phagemid| , condizioni di crescita, la natura della polipeptide saltò a pIII, e la fenditura proteolitica del |fu| di pIII di anticorpo¬|sions|.
Il sistema di vettore di |phagemid| abilita l'accoppiamento della selezione di affinità (basati sui repertori esposti di peptide o frammenti di anticorpo) al ricupero del gene pacco che codifica quelle peptide o anticorpo. Sebbene questo sistema impone poche limitazioni tale come cancellatura di gene ed instabilità di plasmidio, esso è con successo usato isolare i frammenti di anticorpo contro una vasta gamma di proteine, DNA, i marcatori, virus e parassiti del superficie di cella. Vettori di Phagemid permette anche o la mostra condizionale dell'anticorpo su |phage| o l'occultamento dell'anticorpo nello spazio di |periplasmic| di |coli| di E. in un form che potere essere facilmente scoperto, e.g., per ELISA.

1.3. La molecola di anticorpo: un sinossi
1.3.1. Struttura
La comprensione di basic della struttura di anticorpo è necessario per la clonazione riuscita di geni di anticorpo. Tutti anticorpi hanno una struttura di base consistere di un paio identico di polipeptidi di catena pesanti ed un paio della luce identica incatena le polipeptidi tenne insieme per ponti di disolfuro e |nonco|¬il |valent| collega ( per una visualizzazione veda 20 ). Ognuno delle catene pesanti si codifica per vicino: variabile (VH), la diversità (D), congiungendo (JH), e continuo (CH) gli intervalli genetici; mentre ognuno delle catene leggere si codifica per per VL, JL, e cl intervalli. Il DNA e le sequenze di amminoacido della regione di C sono relativamente conservato dentro uno specie dato mentre quei della v regione è il dipendente di antigene. Appaiare delle regioni di v-d j pesanti di catena ed accendono le regioni di v j della catena crea un contro¬la rilegatura di informazioni situa (|paratope|) che riconosce una singola contro¬il determinante genico (|epitope|). Ogni v regione consiste di una struttura di avvisendare (FW) , che è conservò più, e tre di pubblicitario variabile o determinare di complementarità con riferimento a¬i |gions| (CDRs) con grande ordini in sequenza la diversità. Il CDRs, ed ad un'estensione minore le regioni di FW, interaga con l'antigene a formare il centro di un luogo di rilegatura di antigene. Il primo 2 CDRs codifichi si durante il v segmenti mentre il terzo CDR è il prodotto del congiungimento di di v-d j per il cattivo incateni o di v j per la catena leggera. Questa conoscenza della struttura di anticorpo ha facilitato la creazione di molecole di anticorpo completamente esterno il loro oste naturale.
1.3.2. I meccanismi responsabile per la diversità di luoghi di rilegatura di antigene
Un numero enorme degli anticorpi diversi si può generare per il sistema immunitario, ognuno ha un luogo di rilegatura di antigene unico (|paratope|) generato per i domini di N finale delle catene pesanti e leggere. Diversi meccanismi sono responsabile per la diversità dei |paratopes| 21: (i) una diversità recombinatorial: creato dalla selezione casuale di un gene di catena pesante variabile (VH), un gene di diversità (D) ed un cattivo congiungendo (JH) |minigene|, o una luce variabile incatena il gene (vl) ed una congiunzione leggera (JL) l'intervallo di gene fuori una piscina, a costituire il VH e VL domini, |respec|¬|tively|; (II) una diversità congiungimenta: appeso per i meccanismi di congiunzione imprecisi e per cancellatura o somma delle nucleotidi casuali ai contorni dei |minigenes| di VH di d jh di ricombinare; e (iii) una diversità combinatoria: generato per la riunione del VH e vl domini. Altri meccanismi includono: (i) l'ingrandimento dell'architettura del |paratope| aggiustando l'angolo tra il VH associato e vl domini; e (II) la maturazione specifica del |paratope| causata per un |hypermutation| somatico che migliora la complementarità di forma dell'anticorpo con l'antigene. Il cu-
Proponga 1 caratteristiche dell'anticorpo si frammentano
L'anticorpo mette in ordine di grandezza Paratopes Structure Fragment (kDa) (valenza)
ScFv 25-30 1 il vl domini di VHand si collega per un 15 |aa| si collega. Cambiare la lunghezza di collegamento dirige la formazione di |diabodies| ( 60 KDa ), |triabodies| ( 90 KDa ) o |tetrabodies| ( 120 KDa )
Fv 25 1 VH e VL senza il collegamento tra il v domini
Minibody 80 2 una proteina di fusione di scFv-CH3 che auto- assembles in un dimero bivalente di 80 KDa
Favoloso 50 1 composto di due chains:VH-CH1 e vl-cl
il F ( il |ab|?)2 100 2 Due molecole favolose
150 2 molecola di anticorpo di genitore di IgG: due cattivo incatena ( VH-CH1-CH2-CH3 ) e due luce incatena (vl-cl)
effetti di |mulative| di questi meccanismi determinano il contro¬genica affinità e specificità di un anticorpo.
1.3.3. Frammenti di anticorpo
Le molecole di anticorpo contengono i domini di proteina distinti che si possono separare per digestione di proteasi o prodotto per la tecnologia ricombinante. Due rilegatura di antigene si frammenta designò favoloso e Fv sia clonato ed espose nel |phage|. I favolosi più grandi (anticorpo di frammento) consiste di CH di VH e vl-cl intervalli collegato per gli obbligazioni di disolfuro. I più piccoli Fv ( frammenti variabile ) è composto del VL e regioni di VH solo. La versione ricombinante del Fv si chiama il frammento variabile di catena singola (scFv). Le dui regioni variabili nello scFv sono congiunti artificialmente con un collegamento di peptide flessibile, di solito un 15 collegamento di |aa| è usato con la sequenza (Gly4Ser) 3, ed espresse come una catena di polipeptide singola. Il collegamento permette l'associazione del VH e VL a formare il legare di antigene il luogo. un sommario del carattere¬i |istics| dei frammenti di anticorpo diversi si presentano nella tavola

Le rappresentazioni schematiche del |mol| di immunoglobulina intatto¬|ecule| e diversi frammenti di anticorpo di |monomeric| sono pre¬il |sented| in figura 2.
Costruzione e schermatura delle biblioteche di anticorpo di |phage| esposto
2.1. La costruzione del |phage| di scFv espone le biblioteche
Uno delle domande più potenti di mostra di |phage| sono l'isolamento degli anticorpi ricombinanti con una specificità unica 3,4,7,8,22. In questo riguardo, |phage| esponga la tecnologia si può usare a: (i) generi anticorpi monoclonali umani o umanizzano gli anticorpi di topo, significativo per immunoterapia di cancro, (II) isola anticorpi umani da pazienti esposti a certi agenti patogeni virali a meglio sotto¬

H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 429

Fico 2. La struttura del G di immunoglobulina intatto (IgG) molecola, un |minibody|, ed anticorpo di |monomeric| si frammentano: Favoloso (frammento di anticorpo), Fv (il frammento variabile), e ScFv (la singola incatena il frammento variabile). I domini variabili di pesante (VH) ed accenda (vl) le catene si rappresenta per gli ovali di per iscritto, rispettivamente. Le regioni continue di pesante (CH1-3) ed accenda (cl) le catene si rappresenta per gli ovali ombreggiati e tratteggiati, rispettivamente. ABD? il dominio di antigene impegnativo (|paratope|).

H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445

metta il puntino sull'analisi di macchia ( a scoprire entrambi i |phages| esponendo ScFv e solubile ScFv prodotto per il protetto clonano ). I cloni positivi possono essere più lontano caratterizzato per DNA impronta digitale, usando un'enzima di restrizione di tagliatore frequente, del |ampli| di PCR¬il |fied| ScFv inserisce ed ordinamento di DNA.
2.2. I tipi di repertori di anticorpo
2.2.1. Na?¨repertori di |ve|: "la singola spara le biblioteche"
In questa strategia, v geni dall'IgM mRNA delle celle di B dei donatori umani unimmunized isoli si dai linfociti, midollo osseo del sangue periferici, celle di milza, o dai fonti animali. Dal |librar| di pentola singolo umano di di piccole dimensioni¬( 3? 107 l'anticorpo clona ), gli anticorpi è isolato contro antigeni "stranieri" ( e.g., bovina sieroalbumina e lisozima ), gli apteni ( di 2 |phenyloxazol|-5-un ), o " se stesso " contro¬gli informazioni ( tireoglobulina, il fattore di necrosi di tumore?) 25. L'affinità di questi anticorpi era simile quello visto nel |na|¨?la risposta immune primaria del |ve| ed era sufficientemente reattivo in macchia occidentale, ELISA, e l'analisi di facs 25.
un |na| di una certa statura grande¨?la biblioteca di |ve| si costruiva usando il |lym|¬i |phocytes| da su 40 nonimmunized donatori umani e contenne 1.4? 1010 i cloni 26. Gli anticorpi si isolavano da questa biblioteca contro tutti antigeni esaminati con le affinità (Ka) nella serie di |nanomolar| bassa, tipico per una risposta immune secondaria 26. Perciò, né l'immunizzazione né la maturazione di affinità è richiesto per generare la creatura umana contro¬corpi con l'affinità alta.
I vantaggi importanti di repertori di pentola singola includono: (i) |iso|¬il |lation| degli anticorpi umani a se stesso, |nonimmunogenic| o antigeni tossici; (II) una biblioteca singola può essere usato sebbene antigeni; (iii) l'orario ridotto ebbe bisogno per la generazione di anticorpo ( 2-4 i tondi della selezione in due settimane); e (iv) dirige l'isolamento degli anticorpi di affinità alti quando la reputazione molto grande¬i |toires| si usano. Gli svantaggi del |na|¨?le biblioteche di |ve| sono: (i) l'affinità bassa di anticorpi isolò dalle biblioteche di una certa statura piccole; (II) il tempo ebbe bisogno di costruire le biblioteche grandi, e (iii) contenta e la qualità della biblioteca influenzi si per i disuguali
Fico 3. Il diagramma schematico per costruire un repertorio di scFv immune che usa la mostra di |phage|. I rne totali sono primi isolò dalle celle di milza di linfociti di B ed allora mRNA è l'affinità purificata per il |chromatog| di affinità¬il |raphy| nel |oligo| (dT) -cellulose. mRNA è inverso trascrisse in CDNA usando i |hexamers| casuali. Il cattivo ed accendono i geni di anticorpo di catena si amplifica in due le reazioni separate usando due collezioni degli inneschi progettato per ibridarsi per fini opposti della regione variabile di ogni catena. Il cattivo purificato ed accenda i prodotti DNA di catena si riuniscono in un gene singolo usando un DNA collega il frammento costruí per ibridarsi al 3?-il fine del cattivo incatena ed il 5?-il fine della catena leggera. L'assemblato scFv DNA frammenti si amplifichi si per PCR usando una collezione degli inneschi progettato a presentare i luoghi di restrizione per la clonazione in un vettore di |phagemid|. Seguente digestione di restrizione e |ligation| del DNA di scFv al |phagemid| , il vettore di |ligated| si presenta nel |coli| di E. competente per trasformazione di CaCl2 o |electropora|¬|tion|. Phagemid-contenendo le celle batteriche sono adulte ed allora infette con un |phage| di aiutante (M13VCS o KO7), un processo conosciuto come liberazione di |phage|, a produrre i |phages| ricombinanti che esponga l'anticorpo di scFv si frammenta come la fusione ad uno del |phage| riveste le proteine.

H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 431

Proponga 2 variabili considerò in fare una biblioteca di anticorpo
I commenti variabili

Il fonte dei geni di dominio variabili e CDRs: Gli anticorpi di affinità alti a |immunogenic| o antigene di malattia collegata si possono isolare da un ) immune o immune di malattia collegata di biblioteca o |b| di biblioteche di malattia ) naturale o le biblioteche naturali sintetiche di biblioteche o sintetiche sono il fonte meglio per anticorpi a molti antigeni

L'amplificazione di geni di anticorpo per: - a) il |b| di PCR ) i |oligonucleotides| sintetici c ) la combinazione

La configurazione dell'esposto frammenti si: le molecole di ScFv hanno potenziale più alto a formare i |multimers| un )scFv Size( scFv:25 kDa, favoloso 50 KDa )|b|) la stabilità favolosa esce ( favoloso è più stabile )
Sistema di mostra: ? La mostra in molte copie usando la proteina di giacca maggiore G8p (pVIII), o in poche copie un ) Phage o mostra di |phagemid| usando il g3p usando la proteina di giacca minore G3p (pIII) (pIII) o g8p (pVIII)? Per la mostra multivalente usando il g8p (pVIII) , sarà più difficile selezionare
i cloni di affinità più alti
b) I sistemi di mostra cellulari: E. |coli| o fermento? I sistemi di Phagemid usando g3p (pIII) la mostra sono i più frequentemente usati come loro permettono la frequenza alta di mostra monovalente e conversione facile dall'anticorpo di |phage| esposto per anticorpo solubile
c) Mostra di ribosoma? Per sistemi di mostra cellulari, la selezione di cella si può usare ad arricchire i varianti di affinità
? La mostra di ribosoma offre un sistema di evoluzione molecolare libero di cella per anticorpi

l'espressione del repertorio di v geni, la storia ignota del donatore di cella di B, e potenziale la diversità limitato del repertorio di IgM.
2.2.2. Il repertorio immune
In questa biblioteca, v geni è derivato dall'IgG mRNA delle celle di B da un animale immunizzato o, in certi casi, creatura umana. Umanizzò i repertori immuni anche possono essere pre¬tagliò usando immunizzò i topi di |transgenic| (|xenomice|). Xe¬i |nomice| sono generato quello alberghi più del v geni di sistema immunitario umano nel |germline| (invece del repertorio immune native di |murine| ) 27. L'immunizzazione di questi topi con un aptene o alcuni risultati di antigene stranieri nella produzione degli anticorpi di uguale umano nelle loro celle di B. I geni di anticorpo si possono ristabilire dalle celle di B per PCR e selezione di biblioteca o per la fusione in una linea di cella monoclonale per la tecnologia di |hybridoma|.
Una biblioteca di anticorpo immune ha due carattere principale¬|istics|: (i) esso si arricchirà nel |antibod| di antigene specifico¬, e (II) alcuni di questi anticorpi avrà la maturazione di affinità di |undergone| per il sistema immunitario 13,28. Im¬le biblioteche di |mune| si usavano a produrre anticorpi contro l'antigene di |carcino| embrionale (CEA) 29, |recep| di cella di T¬il picco-v? 30 e laurei si il |histocompatibility| Complex/pep¬complessi di marea 31. Anticorpi di alta affinità erano con riferimento a¬la |portedly| dedotta dai topi 31, i polli 32, ed i conigli 33. Le biblioteche di anticorpo erano dedotti anche dalla pecora 34, atterriscono ed i primati nonhuman 35.
Gli svantaggi delle biblioteche immuni includono: (i) il tempo lungo richiede per immunizzazione animale, (II) la mancanza di im¬la risposta di |mune| a se stesso o antigeni tossici, (iii) gli unpri¬il |dictability| della risposta immune all'antigene di interesse, (iv) una nuova biblioteca di anticorpo si deve costruire per ogni antigene ( questo aumenta il tempo totale della procedura per 1-3 i mesi ) , e (v) restrizioni nell'informazioni¬gli anticorpi umani del |erating|.
una domanda unica delle biblioteche immuni deve clonare gli anticorpi di alta affinità presenti dopo infezioni virali o può¬|cer|, e gli anticorpi ad auto- antigeni presenti in pazienti con le malattie di |autoimmune|. L'analisi di tali anticorpi può aiutare nell'identificazione dei |epitopes| antigenici complicato nella risposta immune umorale. una seconda domanda delle biblioteche immuni coinvolge la rimozione di anticorpi irrilevanti; questo si può usare a generare anticorpi contro minore o poveramente antigeni di |immunogenic|. Gli animali si possono fare tollerante a certi antigeni poi immunizzi con una mistura dell'antigene attinente e gli irrilevanti. Questo approccio si usava ad isolare gli anticorpi di |antimelanoma| umani dalle biblioteche di |phage| dei malati di cancro immunizzate con il |tu| di |autologous|¬celle di |mor| 36.
2.2.3. I repertori sintetici
La specificità di alcune anticorpo risiiede nella sei complementarità determinando regioni (CDRs) che plasma l'antigene legando situano ( 3 CDRs su ognuno della luce pesante e variabile variabile incatenano ). Si diventava ovvio da studi strutturali che cinque del sei CDRs abbia limitato la variazione strutturale 37. Il CDR3 della catena pesante (VH-CDR3) è il cappio più diverso in composizione e lunghezza ( valutò la diversità potenziale di 1023 sequenze )
38 ed è più centrale al legare di antigene il luogo di tutto CDRs. Perciò, i repertori sintetici possono essere fatti casualizzando la regione di VH-CDR3 usare mutagenesi di |oligonucleotide| diretto o le tecniche di base a PCR. Diversi repertori sintetici si facevano usando le stratege diverse che includono l'uso di casualizzò accenda si e la catena pesante CDR3s 39 e divereficando tutto tre CDR fa in un intervallo di v geni 40. un vantaggio maggiore dei repertori sintetici sul |na|¨?il |ve| uno sono i potenziali a controllare e definire i contenuti, variabilità locale e diversità complessiva delle biblioteche sintetiche.

2.3. La selezione di biblioteche di anticorpo: "panoramica di biografia"
Le biblioteche di anticorpo si proteggono ed arricchí per cloni di antigene specifico per una tecnica conosciuta come la panoramica di biografia in che i |phages| esponendo scFv si sta in incubatrice con un |immo|¬l'antigene di |bilized| dell'interesse 25,28. I |phages| slegati si rimuovono lavando mentre |phages| esponendo ScFv che leghi specificamente l'antigene si elue, cambiando le condizioni di rilegatura, ed amplificò nel |coli| di E.. Questo ciclo di selezione si illustra in figura 4. Idealmente, solo un ciclo della selezione dovrebbe essere richiesto, comunque la rilegatura di non¬il |phage| specifico limita l'arricchimento che può essere realizzato per ciclo. In pratica, diversi tondi della selezione sono il |nec|¬il |essary| ( medi 2-4 i cicli ). Diverso |strate| di panoramica di biografia¬i |gies| (Figure 5) si discutono sotto.
2.3.1. La selezione usando gli antigeni immobilizzati
Le biblioteche di Phage si selezionano fluendo attraverso un |affin|¬la colonna di |ity| con l'antigene immobilizzato dell'interesse 28,41. Seguire la lavatura della colonna a rimuovere cloni nonspecific, le persona che lega specifiche si eluono ed amplificano nel |coli| di E.. La selezione si può darsi una rappresentazione anche contro antigene adsorbito sui superficie plastici tale come i |immunotubes| ( i tubi di Maxisorb; Nalge Nunc Intl., Naperville, IL ) o il |immu| di enzima collegata¬il |nosorbent| saggia (ELISA) placchi 42,43. Alternativamente, un¬il |tigen| si può immobilizzare nei microcircuiti dei sensori di BIAcore 44.
Esso dovrebbe essere celebre quella selezione del metodo di immobilizzazione deve il prendere nella considerazione l'integrità conformazionale dell'antigene immobilizzato. Alcuno |antibod| di |phage|¬selezionammo contro un antigene adsorbito potere potere riconoscere il nativo forma dell'antigene. Un modo al |cir|¬il |cumvent| tale problema deve assumere il rivestimento di antigene indiretto attraverso l'uso degli anticorpi di cattura di antigene specifico 45.
Gli anticorpi di |phage| esposto specifici si possono eluire dai loro antigeni specifici con le soluzioni silicee ( tale come HCl o buffer di glicina ) 43,46 , con soluzioni di base tale come il |trieth|¬il |ylamine| 42, per la fenditura di |enzymatic| di un luogo di proteasi costruita tra l'anticorpo e g3p 47 , o per il |com|¬la petizione con l'antigene di eccedenza 28.
2.3.2. La selezione che usa antigeni nella soluzione
Questa tecnica permette la soluzione legando e superano problemi con i cambi conformazionali che sono incontrati su rivestire antigeni nei superficie solidi. L'uso di identificò gli antigeni solubili permettono anche una quantificazione più accurata dell'antigene usata durante la selezione 48 e di conseguenza migliori l'abilità ad usare abbassa concentrazioni dell'antigene a favorire la selezione di anticorpi di |phage| di alta affinità. Seguire l'incubazione degli anticorpi di |phage| con antigene di |biotinylated|, il |phage| balzi all'antigene identificato ristabilisca si con |avidin| o perline paramagnetiche di |streptavidin| rivestito. Spe¬i |phages| di |cific| sono dissociati poi dall'antigene e salmerino¬|acterized|. Alcuni svantaggi di questa tecnica sono quello contro¬anticorpi di |streptavidin| si isoleranno. Comunque, questo problema può essere risoluto per un passo di sfruttamento eccessivo usando il |strepta|¬di |vidin| rivestito munono di grani.
2.3.3. La selezione in celli
Diriga la selezione di anticorpi contro marcatori nei superficie di cella può essere effettuare nell'uno o l'altro |monolayers| del |adher|¬celle di |ent| o in celli nella sospensione. Il |phage| slegato si può lavare via sciacquando i fiaschi di cultura di tessuto (|monolayers|) o |centrifugation| (sospensione di cella). Ad ottimizzare il |isola|¬il |tion| delle persona che lega di antigene specifico e minimizzi la rilegatura di persona che lega irrilevanti, una selezione positiva simultanea e negativa si può applicare a 49. In questo approccio, un |compe|¬il |tition| si innalza tra un numero piccolo di celle di obiettivo di antigene positivo ed un'eccedenza di celle di "assorbitore" di negativo di antigene a legare gli anticorpi della biblioteca di |phage|; le celle di assorbitore servono come un lavandino per l'aderenza nonspecific delle persona che lega irrilevanti. un anticorpo fluorescentemente identificato contro un |irrele|¬l'antigene di |vant| presenta solo nelle celle di obiettivo aggiunga si e FACS si usa ad isolare le celle di obiettivo che legano gli anticorpi di |phage| specifici. Usare una tecnica simile ed alcuni ricercatori di biblioteca favolosi isolarono diverso contro-Rh (D) il |antibod| favoloso¬del significato clinico 50. Gli approcci simili si possono utilizzare ad identificare antigeni di tumore specifico putativi ed in pro¬il |vide| un approccio di prodotto alto rapido per isolare auto- replica¬l'anticorpo di |tive| si frammenta diresse contro romanzo o |conforma|¬la cella di dipendente di |tionally| affiora i marcatori. Un altro gruppo sottopose una biblioteca di scFv a tre tondi della selezione positiva in celle di melanoma umane e selezione negativa su celle mononucleate periferiche umane di sangue 51. Due cloni di scFv si isolavano che riconoscono le celle di melanoma in ELISA e . Le selezioni anche possono essere effettuare nelle sezioni di tessuto così come i tessuti interi.
2.3.4. La selezione in vivo
In questi repertori di |phage| di metodo è iniettato direttamente negli animali ed allora tessuti raccolga ed esamini per il confine di |phage| per |endothelial| di tessuto specifico i marcatori di cella come faccia una dimostrazione per il |phage| di peptide 52. Pasqualini e Ruoslahti 52 erano il primo ad isolare le peptide di |phage| esposto che la casa per letti vascolari selettivi in vivo. La panoramica in vivo ha diversi vantaggi: (i) i |dis| di |phage| isolati¬la casa di peptide giocata selettivamente agli obiettivi "intatti" di in¬|terest|; (II) un passo di bloccare inerente si include dove più delle peptide di |phage| esposto che riconoscono plasma onnipresente e cella affiorano le proteine si eliminano; (iii) queste peptide può essere utile per l'analisi funzionale di nuovi recettori ed identificazione potenziale del romanzo drogano candidati di obiettivo perché parte delle peptide isolate è fondi per legare a recettori di |endothelial| espresse nel |vasculature| dei tessuti specifici.
2.3.5. Commenti
Molti laboratori hanno esperimentato difficoltà pratiche con proteggere le biblioteche di |phage|. Ad esempio, la panoramica di

H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 433

Fico 4. La panoramica di biografia della biblioteca di mostra di |phage|. La biblioteca si protegge in quattro passi: (1) la rilegatura dei |phages| all'antigene di obiettivo ( in questo caso l'antigene immobilizzò in un appoggio solido ), (2) lavando a rimuovere |phage| slegato, (3) la dissociazione a recuperare il |phage| di antigene specifico, e (4) l'amplificazione del |phage| di antigene specifico per l'infezione del |coli| di E.. La cautela si deve esercitare durante i passi impegnativi e di lavatura ad evitare forza ionica bassa o altre condizioni che possono favorire l'adsorbimento del |phage| direttamente su plastico o altra matrice.

Fico 5. Gli approcci diversi per la panoramica di biblioteche di |phage|. Colle di antigene¬|umns|: le biblioteche di |phage| si possono selezionare per fluire la biblioteca attraverso una colonna con l'antigene immobilizzato. Gli antigeni ricoperti: le biblioteche di |phage| si possono selezionare su antigene adsorbito nel superficie plastico. La selezione che usa il |biotinyl|¬in antigeni nella soluzione: questo metodo si usa <a> evadere il cambio conformazionale dell'antigene che accade durante rivestire. Balzi ed i |phages| slegati si separano usando le perline magnetiche di |avidin| rivestito. La selezione in celli: dia una rappresentazione direttamente nei |monolayers| delle celle o in celli nella sospensione; i |phages| slegati si rimuovono per domano risciacquatura o |centrifugation|. La selezione in vivo: in queste biblioteche di |phage| di metodo è iniettato direttamente negli animali ed allora tessuti raccolga ed esamini per il confine di |phage| agli antigeni di tessuto specifico.
le biblioteche di anticorpo soffrono da fallire per arricchire per anticorpi specifici e ricupero di anticorpi bassi in affinità soli. La perdita selettiva dei |phages| di alta affinità durante i cicli di selezione si può correggere per aumentare la severità dell'eluizione di |phage| dall'antigene di obiettivo. D'altra parte, esaminare il gene di anticorpo inserisce la taglia nei |phagemids| è¬il due panoramica di |tween| va in bicicletta indicò che la frazione di |phages| con l'inserto in grandezza naturale decresciuto durante l'amplificazione 53. Phages con l'inserto più piccolo ( di solito perdendo la regione di VH ) tendono a coprire i |phages| con inserti in grandezza naturale nelle culture mescolate. Questo si può abolire scegliendo un certo numero di |phagemid| individuale clonano (con inserti in grandezza naturale) dopo le culture pure ultime di ciclo di panoramica e miscela per un anticorpo di "|polyclonal|". Perciò, aggiustare le procedure di eluizione e schermatura durante la selezione può determinare se |phages| di alta affinità si seleziona o scarta.
2.4. La produzione delle molecole di scFv solubili
Per produrre solubile ScFv, i |phages| di antigene positivo si usano ad infetti uno sforzo specifico del |coli| di E. ( e.g., E. il |coli| HB2151 ) quello diriga la produzione di solubile ScFv. Tale
E. lo sforzo di |coli| si chiama le celle di "nonsuppressor" come loro |rec|¬il |ognize| un'ambra ferma codone, pianificò tra e g3 nel |phagemid|, ed unico espresso lo scFv senza la proteina di g3p. Il |phagemid| è anche designato presentare il cartellino di |polyhistidine| muní di miccia all'espresso ScFv, in tal modo permettendo la purificazione di proteina rapida e semplice per immobilizzò massicci la cromatografia di affinità. Dipendere sull'isolato cloni, gli anticorpi solubili possono essere presenti nella cultura surnatante, il |periplasm| batterico, And/or dentro le celle batteriche. Tutte tre frazioni si devono isolare ed analizzare in una macchia occidentale, usando un commercialmente disponibile il |antihistidine| coniugato ( il suo ) metta un'etichetta l'anticorpo, a determinare l'ubicazione degli anticorpi solubili. Solubile scFv è il rela¬|tively| semplice ad isolare, potere essere economicamente prodotto nel |bacteria| in quantità molto grandi 54,55, e non comportano le procedure refolding complesse 56.
3. Migliorare l'affinità dell'anticorpo di |phage| si frammenta
Sebbene gli anticorpi selezionarono da molto immune o biblioteche di pentola singola di una certa statura grande pari può essere estremamente uso¬il |ful| per gli scopi di ricerca in ELISA, le macchie occidentali, o im¬|munofluorescence|; la loro affinità non è spesso sufficiente per l'uso come i reagenti diagnostici sensibili.
La maturazione di affinità si può circonvenire facendo le molecole multivalenti 57; comunque, la stuoia di affinità in vitro¬il |uration| degli anticorpi selezionati si può richiedersi ancora in certi esempi. V-il gene incatena mescolando 28 e |mu| di luogo diretto¬i |tagenesis| sono usato per la maturazione di affinità delle molecole di scFv. Altri metodi per la casualizzazione di sequenze di proteina erano propagazione di inclusione anche applicata dei geni di scFv nel |mutator| di |coli| di E. tendono 58, il PCR di errore prono 48, ed il DNA che strascica 59.
3.1. Formazione di Multimer: migliorare l'avidità di scFv si frammenta
La molecola di scFv è su 30 KDa in taglia e consista OfaVH e vl domini impastoiò insieme via un collegamento di polipeptide ( di solito 15 residui di amminoacido ) quelli servizi ad im¬verifichi espressione ed efficienza piegamenta. una molecola di scFv è

H.M.E. Azzazy, NOI Highsmith Jr./la biochimica clinica 35 (2002) 425-445 435

monovalente con un |paratope| funzionale singolo; di conseguenza esso ha l'avidità bassa. Usare un collegamento corto di 5 residui di amminoacido tra il VH e vl domini dello scFv era fondare a prevenire l'allineamento del v domini in un singolo scFv e faccia strada all'associazione di due molecole di scFv che forma un dimero chiamò un "|diabody|" 60,61. un |diabody|, con una taglia molecolare di su 60 KDa, è un dimero di scFv con due |paratopes| funzionali e più alta avidità che |frag| di scFv¬|ments|. Ridurre la lunghezza del collegamento a tre residui prevenne la formazione di dimeri di scFv ed invece diresse l'associazione di tre molecole di scFv a formare un assetto (un |triabody| di 90 kDa con tre |paratopes|) 61 and/or un |tetrava|¬presti |tetrabody| 62. Bispecificity può essere anche realizzato munendo di miccia due diverso scFv 63,64. Chiaramente, questo approccio permette il disegno di molecole impegnative multi-specifiche con scelto metta in ordine di grandezza e l'affinità funzionale.
3.2. La maturazione di affinità per il mutagenesi di luogo diretto
In questo metodo, gli amminoacidi di alcuni o più del CDRs si agisce come sostituto con residui diversi seguiti per la selezione di cloni con l'affinità più alta per l'antigene di obiettivo. una raffinatura di questo metodo " il |mu| parsimonioso¬i |tagenesis| " sviluppi si 65. In questa strategia, la sequenza di CDR intera di un frammento di anticorpo si protegge al |iden|¬gli amminoacidi di |tify| che sono attivamente complicati nell'antigene incastrando. Primo, il numero di codoni presentò limiti si tale che ogni amminoacido è unico programmò per per un codone singolo. Gli amminoacidi ad ogni posizione sono poi |manipu|¬in ritardo a favorire sequenze parentali, i cambi conservativi, e quei quello appaia più frequentemente nelle regioni di CDR dell'anticorpo. Perché il mutagenesi parsimonioso provvede in¬la formazione sulla contribuzione di amminoacidi distinti a legando e l'affinità, questo processo può essere usato come un iniziale intervenga la maturazione di affinità degli anticorpi ricombinanti.
3.3. La maturazione di affinità per la catena che strascica
Incateni mescolando provvedono modifichi al |af| intrinseco¬il |finity| di un monovalente specifico ScFv. In questo processo, la molecola di scFv fu soggetto ad un serie di manipolazioni in che il gene per una catena ( e.g., il VH ) della molecola di scFv cloni si in un repertorio per la seconda catena (vl) 66. La biblioteca di scFv di risultare conterrà il |phage| di scFv con VH incatenano specifico per l'antigene di obiettivo e vl catene casuale. La biblioteca si tegame contro l'antigene ad identificare cloni con le proprietà di rilegatura migliorate. Il nuovo vl gene è clonato poi in un repertorio di geni di VH. Per mantenere la specificità della molecola di scFv di genitore, il VH CDR3 ( quello contenga più dei residui di contatto all'antigene ) trattenga si senza cambi. Perciò, solo l'intervallo di VH da strutture 1 a 3, includendo il CDRs 1 e 2, sostituisca si. Usare questa strategia, l'affinità di un umano nonimmune ScFv che lega l'antigene di tumore di glicoproteina di c erbB-2 ( Kd? 1.6 ? 10?8 M), aumenti si sei volte ( Kd? 2.5 ? 10?9 M) per catena leggera che strascica e quintuplo ( Kd
Proponga 3 leganti di peptide di esempio selezionarono dalle biblioteche di Phage Display
Referenza di sequenza di peptide di proteina di obiettivo
La peptide di |natriuretic| atriale *MCHFGGRMDRISCYR 155
A di recettore
Concanavalin un MYWYPY 75
GPIIb/IIIa ?CNWKRGDC 156
Steptavidin AECHPQGPPCIEGRK 157
MSRPACPNDKYE di recettore di trombina 79
il TPO ( l'IEGPTLRQWLAARA di |thrombopoietin| umano 158
il recettore )

|compa|¬essere classificato a quei per anticorpi contro lo stesso pro di antigene¬il |duced| per i |hybridomas| 67.
4. Le domande diagnostiche in vitro della mostra di |phage|
4.1. Le domande generali
4.1.1. Domande di peptide di Phage
4.1.1.1. La mostra di Phage delle peptide casuali. Il |oligo| sintetico¬nucleotidi con una lunghezza continua ma con i codoni unspecified, casualizzò attraverso il mutagenesi di luogo diretto ci¬il |ing| degenera |oligodeoxynucleotides|, cloni si tanto le fusioni ad uno delle proteine di giacca del |phage| di M13 dove loro si esprimono come le proteine di fusione di capside di peptide. Le peptide di Phage portato esibono un potenziale di mimico largo al pilotaggio, lineare¬formazione ed i |epitopes| di |nonproteinaceous| 68,69. Queste biblioteche di peptide casuali si possono esaminare per incastrarsi a molecole di obiettivo dell'interesse (Table 3). La mostra di peptide casuali nel batteriofago filamentoso come la fusione ad o g3p o g8p rivestono proteine 1,70 -72 has allowed the identi¬fication of peptides that specifically bind to a variety of targets including antibodies 73, il |streptavidin| 74, |ribonu| ¬clease S 69, e |concanavalin| un 75.